長非編碼RNA LncTSG1抑制肝癌轉移的功能及機制研究.pdf

1、目的:肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生和發(fā)展是一個多因素參與的復雜調控過程。長鏈非編碼RNAs(Long non-coding RNA，LncRNAs)是指不具備蛋白編碼能力的，長度大于200個核苷酸的RNA轉錄本。LncRNA參與調節(jié)細胞增殖、凋亡、遷移、基因組穩(wěn)定性等多種生理過程，其異常表達與多種疾病密切相關，包括腫瘤。因此，尋找到肝癌中異常表達的LncRNA，揭示其在肝癌中的生物學功能及調節(jié)的信號通路，對闡明肝癌的發(fā)生發(fā)展機

2、制、發(fā)現潛在的診斷和治療靶點具有重要意義。
　　方法:采用晶芯(R)lncRNA芯片檢測16對肝癌及癌旁組織中LncRNA的表達，篩選表達差異的LncRNA。通過實時定量PCR技術檢測LncTSG1在肝癌組織與癌旁組織中的表達水平，進一步驗證芯片結果。通過RACE技術鑒定LncTSG1的5'和3'序列，進行數據庫比對并擴增LncTSG1全長。通過在肝癌細胞中上調/下調LncTSG1的表達水平，檢測對肝癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響。

3、通過生物信息學分析技術及RNA Pull Down聯合質譜分析、RIP等實驗方法尋找LncTSG1相互作用蛋白及調節(jié)的信號網絡。
　　結果:采用晶芯(R)lncRNA芯片對16對肝癌及對應癌旁組織中的LncRNA表達進行檢測，分析發(fā)現和癌旁組織相比，LncTSG1在肝癌組織中表達顯著下降。通過實時定量PCR技術對43對肝癌組織及相應癌旁組織中LncTSG1的表達水平進行檢測，發(fā)現相對于癌旁組織LncTSG1在肝癌組織中的表達水平顯

4、著下調，與芯片結果一致。通過RACE技術鑒定出LncTSG1的5'端和3'端序列，并成功擴增出LncTSG1的全長，與數據庫中的序列比對，結果顯示5'端序列與數據庫中注釋的序列一致，3'端序列較數據庫中注釋的序列少約100bp。
　　對表達譜芯片結果進行生物信息學分析，發(fā)現LncTSG1與參與EMT及細胞遷移相關的信號通路關系密切。通過在肝癌細胞中上調/下調LncTSG1的表達，進行相應的細胞功能學實驗，結果顯示，通過轉染LncT

5、SG1的重組質粒上調LncTSG1表達后，肝癌細胞的遷移和侵襲能力降低;通過siRNA干擾下調LncTSG1的表達后，肝癌細胞的遷移和侵襲能力增強，而增殖能力無明顯變化。同時，下調LncTSG1可促進肝癌細胞發(fā)生EMT轉變。
　　熒光原位雜交及細胞組分分離技術證實LncTSG1主要定位于細胞漿。采用生物信息學方法分析并通過RIP實驗發(fā)現LncTSG1可與AGO2結合，提示LncTSG1在胞漿中可作為ceRNA發(fā)揮作用。通過預測軟件

6、分析可能與LncTSG1結合的micoRNA，并通過文獻檢索，發(fā)現has-miR-372和has-miR-10b與腫瘤的轉移相關，是LncTSG1潛在調控靶點。通過實時定量PCR檢測二者下游靶基因的表達水平，發(fā)現抑制LncTSG1的表達能夠顯著下調腫瘤轉移相關基因ARHGAP6、CELF2、MAPK10、TNS1、SYNPO2的表達，表明LncTSG1可能通過干擾has-miR-372和has-miR-10b對下游mRNA的調控來發(fā)揮c