長鏈非編碼RNA FER1L4抑制胃癌發(fā)生的分子機制研究.pdf

1、研究目的：
　　我國是胃癌多發(fā)的國家，居世界之首。研究表明，長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）與胃癌發(fā)生發(fā)展有密切聯系。lncRNA的作用機制多種多樣，它可以通過RNA產物和轉錄后干擾等調控基因的表達。雖然，人們對lncRNA的作用機制有一定的認識，但是lncRNA研究還處于起步階段，還有很多問題尚未解決。本課題組前期研究發(fā)現 fer-1樣家族成員4（fer-1-like family mem

2、ber4，FER1L4）這一lncRNA在胃癌組織中低表達，但其具體作用機制尚不完全清楚。為此，本論文以FER1L4作為研究的對象，采用多種技術手段，探究FER1L4抑制胃癌發(fā)生的機制。
　　實驗方法：
　　1.采用功能缺失策略，設計FER1L4的shDNA模板序列，將其插入慢病毒干擾載體pGLV3/H1/GFP+Puro中，構建慢病毒干擾載體，使其能轉錄出FER1L4的shRNA。
　　2.采用功能獲得策略，合成FE

3、R1L4功能片段，并將其插入慢病毒表達載體pLVX-Puro中，構建慢病毒過表達載體。
　　3.慢病毒干擾載體和慢病毒過表達載體分別與包裝載體一起共轉染人腎HEK293T工具細胞，進行慢病毒包裝，以獲得病毒液。
　　4.病毒液感染正常胃黏膜上皮細胞GES-1和不同分化程度的胃癌細胞AGS、MGC-803和SGC-7901。Puromycin篩選穩(wěn)定下調和上調FER1L4的細胞株。
　　5.收集穩(wěn)定下調和上調FER1L4

4、細胞株，提取總RNA，對總RNA進行逆轉錄和FER1L4的實時熒光定量分析，檢測FER1L4水平是否下調和上調。
　　6. RTCA檢測穩(wěn)定下調和上調FER1L4后，細胞的增殖情況?？寺⌒纬蓪嶒灆z測穩(wěn)定下調和上調FER1L4后，細胞的克隆形成情況。
　　7.為進一步驗證FER1L4的抑癌作用，設計并合成FER1L4基因CRISPR Cas-9的sgRNA，并將其插入到CRISPR Cas-9載體pX330和pX335中。細胞

5、轉染，提取總RNA，檢測CRISPR Cas-9敲除FER1L4后，細胞中FER1L4 RNA的水平檢測。RTCA檢測CRISPR Cas-9敲除FER1L4后，細胞的增殖情況。
　　8.檢測下調和上調FER1L4后，細胞中PTEN的水平。檢測miR-106a-5p抑制劑處理正常胃黏膜上皮細胞株和胃癌細胞株后，FER1L4和PTEN的水平，以證明FER1L4和PTEN mRNA的競爭性內源RNA關系。
　　實驗結果：

6、　　1.成功建立FER1L4慢病毒穩(wěn)定干擾細胞和慢病毒穩(wěn)定過表達細胞株，qRT-PCR檢測到細胞中FER1L4的水平的下降和上升符合預期。
　　2.細胞中FER1L4水平下調后，細胞增殖加快，克隆增多；而細胞中FER1L4水平上調后，細胞增殖減慢，克隆減少。
　　3.篩選出4個CRISPR Cas-9 sgRNA，pX335插入sgRNA4后，能促進細胞的增殖。
　　4.下調FER1L4的水平后，PTEN的mRNA水平