長非編碼RNA lnC-MC及RBp-ZFP36L1在單核-巨噬細胞分化中的功能及其機制研究.pdf

1、造血是由造血干細胞經過一系列增殖、分化最后形成各種成熟血細胞的過程。這個過程涉及由轉錄因子、細胞因子和非編碼RNA等組成的復雜調控網絡。單核/巨噬細胞屬于白細胞，也是一類非常重要的固有免疫細胞，同時也在啟動適應性免疫應答方面發(fā)揮著重要作用。單核/巨噬細胞分化是整個造血鏈系發(fā)育的一部分，也受到一個復雜調控網絡的精細調控。它的分化發(fā)育異常與急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展以及機體系統(tǒng)紊亂等眾多生理病理過程密切相關。
　　長非編碼RNA（lnc

2、RNAs）是一類長度大于200nt，不編碼蛋白的RNA分子。越來越多的研究表明lncRNAs可以在染色質重塑、轉錄以及轉錄后等多個層面調控基因的表達，參與調節(jié)眾多生物學過程。然而，lncRNAs在造血領域的研究還處于起步階段，有關lncRNAs在單核/巨噬細胞分化中的功能和機制還鮮有報道。RNA結合蛋白(RBPs)是一類可以在體內結合單鏈或雙鏈RNA的蛋白分子，通過特定的RNA結構域識別并結合RNA，參與RNA的剪切成熟、運輸、定位、翻

3、譯、降解等眾多RNA代謝過程。研究表明，RBPs介導的轉錄后調控在哺乳動物發(fā)育以及疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。然而，RBPs在單核/巨噬細胞分化中的功能和機制也還鮮有報道。在本課題中，我們通過生物信息學分析以及實驗驗證，鑒定了一條參與單核/巨噬細胞分化的長非編碼RNA(lnc-MC)，也篩選到了一個介導單核/巨噬細胞分化的RNA結合蛋白ZFP36L1。
　　通過分析白細胞里的RNA-Seq數(shù)據(jù)以及ChIPBase中的PU.

4、1-ChIP-Seq數(shù)據(jù)，我們篩選到了390個可能受到PU.1調控又在白細胞中表達的lncRNAs。結合它們在白細胞中的表達豐度以及物種保守性和編碼潛能預測分析，我們把研究集中在了lnc-MC上。Lnc-MC，又名lnc-TRIP10/TCONS_00026873/XLOC_012931，在基因組上的位置為Chr19:6656385-6662832，有兩個外顯子;缺乏長而有效的開放閱讀框，更傾向于是一條非編碼RNA;只在靈長類動物中比較

5、保守，其它物種不保守。Lnc-MC在佛波酯(PMA)誘導THP-1和HL-60以及體外誘導臍帶血來源的CD34+造血干/祖細胞(HSPCs)向單核/巨噬細胞分化過程中表達逐漸上調。敲低和過表達實驗證明lnc-MC可以促進人單核/巨噬細胞分化。染色質免疫沉淀以及單核分化關鍵轉錄因子PU.1敲低和過表達實驗證明在單核/巨噬細胞分化過程中，PU.1可以結合于lnc-MC基因上游1826bp位點，轉錄激活lnc-MC的表達。我們也曾證明PU.1

6、抑制pri-miR-199-2轉錄，導致miR-199a-5p減少，而miR-199a-5p可以通過靶向ACVR1B介導的TGF-β信號通路來抑制單核/巨噬細胞分化。通過RNA熒光原位雜交以及胞質胞核RNA分別抽提并PCR實驗發(fā)現(xiàn)lnc-MC主要定位于細胞質中，提示其可能主要作為一類轉錄后調控因子參與單核/巨噬細胞分化。我們通過RNAHybrid預測分析以及實驗證明lnc-MC可以和miR-199a-5p相互作用，相互抑制表達并降低可利

7、用性。然而，在單核/巨噬細胞分化過程中，PU.1調節(jié)的lnc-MC上調和miR-199a-5p下調使lnc-MC在二者相互競爭中處于優(yōu)勢，從而減弱了miR-199a-5p對于ACVR1B的抑制作用，促進分化。因此，我們的研究揭示了一個新的由lncRNA參與的造血調控機制，即PU.1轉錄調控的兩個非編碼RNA，lnc-MC和microRNA-199a-5p，在轉錄后相互拮抗，通過調節(jié)ACVR1B介導的TGF-β信號通路參與單核/巨噬細胞分

8、化。
　　通過分析108例急性髓系白血病(AML)病例芯片以及體外誘導髓系分化芯片資料，我們篩選到了23個既在AML病例中又在體外誘導髓系分化中差異表達的RBPs，最后我們把研究集中在ZFP36L1上。芯片分析結果表明，ZFP36L1在絕大多數(shù)AML病例芯片中表達下調，而在體外誘導HSCs向單核系分化的芯片中表達逐漸上調。實驗驗證發(fā)現(xiàn)，ZFP36L1在初診AML病例中的表達與正常對照相比明顯下調，在PMA誘導THP-1和HL-60

9、以及體外誘導臍帶血來源的CD34+HSPCs向單核/巨噬細胞分化過程中表達逐漸上調，與芯片結果一致。敲低和過表達實驗證明ZFP36L1可以促進單核/巨噬細胞分化。據(jù)文獻報道，ZFP36L1屬于鋅指蛋白家族成員，可以結合于mRNA3'UTR的富含AU的元件（ARE），在轉錄后水平負調控基因的表達。因此，為了尋找ZFP36L1下游的靶基因，我們參考AREsite數(shù)據(jù)庫結合芯片分析，最終篩選到了CDK6作為一個潛在的靶點。報告基因實驗以及RN

10、A免疫沉淀實驗表明，ZFP36L1可以結合于CDK6 mRNA3'UTR的ARE元件，導致CDK6 mRNA的降解以及蛋白表達水平降低。在CD34+ HSPCs中通過慢病毒介導的過表達實驗證明了CDK6可以抑制單核/巨噬細胞分化。最后我們又通過ZFP36L1—CDK6的rescue實驗，進一步證明了ZFP36L1是通過抑制CDK6的表達來促進單核/巨噬細胞分化的?？傊?，我們的研究結果揭示了一個由ZFP36L1—CDK6介導的單核/巨噬細