MYOD下游長鏈非編碼RNA的篩選及兩個LncRNAs在成肌細胞分化中的功能研究.pdf

1、骨骼肌的分化發(fā)育是一個精細的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，有多種功能性分子參與其中。Long non-coding RNA(lncRNA)是一類調(diào)控多種生物學功能的非編碼RNA，在癌癥和腫瘤組織中被廣泛的研究。目前針對影響肌肉分化發(fā)育的lncRNA研究已有初步進展，但仍有大量lncRNA有待挖掘。本研究以高通量芯片技術(shù)為主要研究策略，結(jié)合差異表達的lncRNA和mRNA，鑒定出兩個受MyoD因子調(diào)控并影響肌細胞分化的lncRNA，主要研究結(jié)果如下:

2、r>　　1.利用MyoD特異的siRNA轉(zhuǎn)染C2C12細胞，待細胞分化2天后收集RNA和蛋白質(zhì)，采用Q-PCR和Western Blotting技術(shù)檢測敲低效率，同時檢測調(diào)控上游/下游基因表達，發(fā)現(xiàn)MyoG、MyHC表達量隨著MyoD基因干擾顯著下降，上游基因無變化。利用lncRNA和mRNA芯片篩選了敲低MyoD后差異表達的lncRNA和mRNA，得到642個下調(diào)表達和335個上調(diào)表達的lncRNA。通過相關(guān)性分析，找出與這些差異變化

3、lncRNA相關(guān)的差異mRNA，利用軟件對這些mRNA進行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)這些基因大都富集在與肌肉生成或肌肉運動相關(guān)的通路中。
　　2.從基因芯片結(jié)果中篩選了37個表達量高且芯片差異倍數(shù)大的lncRNA，在小鼠13個組織中研究了基因表達情況。結(jié)果顯示，9個lncRNA(MM9LINCRNAEXON11961-、AK141672、AK031663、ENSMUST00000150337、AK017263、ENSMUST0000

4、0154720、AK160312、AK163925、ENSMUST00000104935)在肌肉組織中高表達，AV570737等8個lncRNAs在睪丸組織高表達，AK139402等4個lncRNAs在腦中高表達，AK052777等7個lncRNAs在肝、腎中高表達，AK143003等9個lncRNAs廣譜表達。
　　3.從肌肉高表達和廣譜表達的lncRNAs中篩選9個進一步分析。構(gòu)建MyoD超表達載體反向驗證9個候選lncRNA

5、s的表達，發(fā)現(xiàn)AK143003、AK017263、ENSMUST00000150337的表達發(fā)生顯著變化。分析了這3個lncRNAs在不同分化時間的表達情況，發(fā)現(xiàn)它們的表達量均在分化初期顯著上升，AK143003高表達能夠一直維持到分化末期，而AK017263和ENSMUST00000150337在分化末期表達降低。
　　4.鑒定分析了AK017263的基因序列，發(fā)現(xiàn)它是一個位于基因間的lncRNA，且轉(zhuǎn)錄起始位點有MyoD、My

6、oG的結(jié)合。利用RACE技術(shù)得到了AK017263的全長序列，并對其編碼能力進行預(yù)測，證明AK017263是一個非編碼RNA。核質(zhì)分離實驗說明AK017263不論在細胞增殖期還是分化期，均存在于細胞核中。利用特異的siRNA降低AK017263的表達，Q-PCR、Western Blotting檢測結(jié)果表明分化標志基因MyoG和MyHC表達量顯著下降，證明AK017263可促進成肌細胞分化。
　　5.鑒定分析AK143003的序列

7、，發(fā)現(xiàn)它位于基因間，在它的轉(zhuǎn)錄位點上游有一個編碼基因Mxd4。Northern、RACE和體外翻譯實驗證明了AK143003是一個單拷貝的非編碼RNA。利用核質(zhì)分離實驗，鑒定出AK143003在細胞增殖期核質(zhì)均有分布，細胞分化期則全部轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中。利用特異的siRNA和構(gòu)建成功的超表達載體對AK143003在肌細胞的功能進行分析，Q-PCR、Western Blotting、免疫熒光檢測MyoG和MyHC的表達，發(fā)現(xiàn)降低AK14300

8、3的表達可以促進細胞分化，而增加AK143003的表達抑制細胞分化。另外，降低AK143003的表達，其鄰近基因Mxd4表達升高，反之降低。這說明AK143003可能通過降低Mxd4的表達負調(diào)控肌肉分化。但Mxd4對肌肉分化的作用還未有人研究。鑒于此，利用真核表達載體和特異siRNA構(gòu)建Mxd4過表達和抑制表達模型檢測其對肌分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降低Mxd4后，MyHC表達量降低，細胞分化受到抑制;超表達Mxd4，MyHC表達量增加，促