豬卵核對(duì)核移植胚胎發(fā)育及其早期基因表達(dá)的影響.pdf

1、目前，哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植重編程效率仍舊很低，作為治療性克隆的首選動(dòng)物模型，豬的核移植胚胎干細(xì)胞系仍然沒(méi)有建立。其技術(shù)瓶頸主要是體細(xì)胞核重編程不完全。卵母細(xì)胞核作為母源遺傳物質(zhì)，對(duì)胚胎發(fā)育甚至體細(xì)胞重編程影響巨大。因此，本研究以豬核移植體系為背景，觀察在不去除卵母細(xì)胞核的情況下，核移植胚胎的體外發(fā)育情況，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，研究高效重編程核移植體系特有的基因表達(dá)模式，為體細(xì)胞核移植重編程機(jī)制以及功能性基因的深入研究奠定基礎(chǔ)，以期找到提高

2、體細(xì)胞重編程效率的突破點(diǎn)。本研究主要內(nèi)容如下:
　　1、豬卵核對(duì)核移植胚胎發(fā)育及體細(xì)胞重編程效率的影響
　　首先構(gòu)建豬不去核核移植胚胎，觀察其發(fā)育潛能。我們一共注射了539枚卵丘細(xì)胞于完整的卵母細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)注射了461枚卵丘細(xì)胞于去核的卵母細(xì)胞內(nèi)，兩組重構(gòu)胚分別融合激活后，有260枚多倍體重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚，同時(shí)僅有93枚去核重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚，相比去核組，不去核胚胎的卵裂率(81.15％ vs91.05％)、囊胚率(20.15

3、％ vs48.29％)均顯著提高。
　　2、鑒定供體細(xì)胞、去核和不去核核移植囊胚染色體數(shù)目
　　對(duì)供體細(xì)胞、去核核移植囊胚以及不去核核移植囊胚進(jìn)行染色體制片，染色并統(tǒng)計(jì)各細(xì)胞染色體數(shù)目，最終確定各細(xì)胞染色體數(shù)目正常(38/38/57，正常豬染色體數(shù)目為38條)。
　　3、不去核核移植囊胚在形態(tài)及細(xì)胞數(shù)上與去核核移植囊胚、孤雌囊胚的差異
　　以孤雌囊胚為對(duì)照，分別對(duì)去核、不去核核移植囊胚細(xì)胞進(jìn)行熒光染色計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)孤

4、雌囊胚平均細(xì)胞數(shù)最多(58.60)，去核核移植囊胚平均細(xì)胞數(shù)最少(43.30)，不去核核移植囊胚平均細(xì)胞數(shù)介于二者之間(56.95)。囊胚形態(tài)上，孤雌囊胚直徑較大，顏色較淺，去核與不去核核移植囊胚直徑較小，顏色較深，且不去核核移植囊胚多為孵化囊胚，呈8字形態(tài)，而去核核移植囊胚多為擴(kuò)張囊胚，未孵化。
　　4、卵母細(xì)胞機(jī)械損傷對(duì)核移植胚胎發(fā)育的影響
　　考慮到去核過(guò)程會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞造成機(jī)械損傷，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)卵母細(xì)胞預(yù)先扎孔，

5、并將卵核吸出再注回，模擬去核操作對(duì)卵母細(xì)胞造成的機(jī)械損傷，隨后進(jìn)行孤雌激活。同時(shí)將對(duì)照組卵母細(xì)胞僅做扎孔處理，不做卵核吸吐動(dòng)作，模擬不去核核移植胚胎操作，觀察兩種胚胎發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)機(jī)械損傷導(dǎo)致孤雌胚胎卵裂率、囊胚率降低(卵裂率93.136％ vs95.032％，P≈0.36;囊胚率56.14％ vs64.42％，P≈0.014)，囊胚細(xì)胞數(shù)減少(52.65 vs55.40)，但抑制作用不顯著。證明機(jī)械損傷這一單方面因素不是造成核移植胚胎

6、發(fā)育能力低下的主要原因。
　　5、染色體加倍對(duì)胚胎發(fā)育的影響以及不去核重構(gòu)胚中的卵核能否被體細(xì)胞核所取代
　　將不去核重構(gòu)胚模型中的卵核用體細(xì)胞核進(jìn)行置換，再移入另一枚體細(xì)胞重新構(gòu)建多倍體胚胎，觀察其發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞核+體細(xì)胞+卵胞質(zhì)胚胎囊胚率僅有10.5％，遠(yuǎn)低于卵核+體細(xì)胞+卵胞質(zhì)胚胎囊胚率50.6％，說(shuō)明在不去核重構(gòu)胚模型中，單純性染色體數(shù)目加倍無(wú)法促進(jìn)胚胎發(fā)育，卵母細(xì)胞核無(wú)法被體細(xì)胞核任意取代。
　　6、卵

7、巢類型與卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的關(guān)系
　　由于卵巢樣品取自市內(nèi)屠宰場(chǎng)，樣品品系不確定，為保證測(cè)序樣品間遺傳背景一致，采取單卵巢采卵獨(dú)立培養(yǎng)。根據(jù)卵巢表面有無(wú)紅體將其分類，分別進(jìn)行卵子采集、成熟，觀察其發(fā)育潛能，發(fā)現(xiàn)有紅體卵巢采卵效率高，所得卵子成熟率(75.77％ vs68.97％，P＞0.05)、卵裂率(95.33％vs94.00％，P＞0.05)、囊胚率(68.67％vs59.00％，P＞0.05)均高于沒(méi)有紅體的卵巢。但差異不顯著

8、，確定可以選擇帶有紅體的卵巢進(jìn)行采卵，然后構(gòu)建核移植胚胎，用于后續(xù)基因表達(dá)圖譜的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。
　　7、構(gòu)建去核、不去核重構(gòu)胚早期基因表達(dá)圖譜
　　為探究卵核對(duì)體細(xì)胞重編程作用的分子機(jī)制，了解兩種重構(gòu)胚特有的基因表達(dá)模式，本研究采集了去核以及不去核重構(gòu)胚2cell（第一次卵裂）和4cell（發(fā)育阻滯期）時(shí)期胚胎進(jìn)行基因表達(dá)譜測(cè)序(RNA sequencing)。成功構(gòu)建兩種重構(gòu)胚各自特異基因表達(dá)圖譜。發(fā)現(xiàn)去核重構(gòu)胚2cell胚胎

9、有大約28％的基因參與表達(dá)，4cell胚胎大約22％的基因參與表達(dá);不去核重構(gòu)胚2cell胚胎有大約30％的基因參與表達(dá)，4cell胚胎有大約27％的基因參與表達(dá)。
　　8、去核、不去核重構(gòu)胚阻滯前期差異表達(dá)基因篩選與分析
　　將去核和不去核重構(gòu)胚相同時(shí)期胚胎基因表達(dá)圖譜進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2cell階段，不去核重構(gòu)胚相比去核重構(gòu)胚有1738條基因呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，728條基因表達(dá)下調(diào)(|log2Ratio|≥5);4cell階段，不

10、去核重構(gòu)胚有2941條基因表達(dá)上調(diào)，1682條基因表達(dá)下調(diào)(|log2Ratio|≥5);這些差異基因WEGO分析中富集程度最深的基因簇分別集中在綁定調(diào)控、催化和分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性上;其他在不去核重構(gòu)胚中呈現(xiàn)高表達(dá)的基因則多數(shù)參與各種代謝過(guò)程。其中，Ribosome和Oxidative phosphorylation兩條信號(hào)通路在去核重構(gòu)胚發(fā)育趨勢(shì)中以及不去核重構(gòu)胚發(fā)育趨勢(shì)中反復(fù)出現(xiàn)富集。在4cell阻滯期階段，Proteinprocessi

11、ng in endoplasmic reticulum信號(hào)通路顯著富集。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核結(jié)構(gòu)緊密相連，并且附著大量核糖體結(jié)構(gòu)，在核移植去核操作過(guò)程中可能連同細(xì)胞核一起被去除。因此推測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工以及核糖體、氧化磷酸化功能的缺失可能是去核重構(gòu)胚較之不去核重構(gòu)胚發(fā)育劣勢(shì)的主要原因。
　　9、核定位轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)模式分析
　　去核、不去核重構(gòu)胚差異表達(dá)基因中有267條轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)基因在細(xì)胞核部位定位表達(dá)，其中絕大多數(shù)在去

12、核重構(gòu)胚中表達(dá)量微弱，但在不去核重構(gòu)胚中表達(dá)顯著上調(diào)。推測(cè)這些核定位表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致體細(xì)胞重編程加快，重編程效果更徹底。
　　10、QRT-PCR基因表達(dá)量驗(yàn)證
　　在RNA-seq差異基因中隨機(jī)挑選了6個(gè)表達(dá)量較高的基因DNMT1、FTL、POLR1D、RPS3、RPS20、BUB3分別進(jìn)行QRT-PCR檢測(cè)。將檢測(cè)結(jié)果與RNA-seq結(jié)果比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，6個(gè)基因在兩種檢測(cè)方法下表達(dá)趨勢(shì)基本一致。
　　11、內(nèi)