基因組重測序基礎(chǔ)上的早實(shí)枳與普通枳部分差異基因比較分析.pdf

1、柑橘是世界范圍內(nèi)栽培最多的果樹之一，其生長發(fā)育需要經(jīng)過漫長的童期，極大地阻礙了柑橘早豐產(chǎn)的獲取和遺傳育種的研究。早實(shí)枳是普通枳的早花變異，兩者之間除了開花習(xí)性不同外，其他特征幾乎完全一樣，前人的研究發(fā)現(xiàn)兩者有相近的遺傳背景，因此它也是研究柑橘成花發(fā)育的絕佳材料。本實(shí)驗(yàn)室對早實(shí)枳與普通枳進(jìn)行了基因組重測序，參考克里曼丁橘全基因組數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)的方法對重測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，得到了較多早實(shí)枳與普通枳存在差異的序列信息。本研究主要通過實(shí)

2、驗(yàn)方法，采用PCR擴(kuò)增和克隆測序?qū)υ鐚?shí)枳與普通枳之間的候選InDel進(jìn)行驗(yàn)證，并對篩選出來的重點(diǎn)基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.對存在于CDS區(qū)域的InDel進(jìn)行分級。以克里曼丁橘基因組為參考，共設(shè)計(jì)引物97對，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳、AT克隆測序的方法對InDel進(jìn)行驗(yàn)證;
　　2.共有83對引物在PAGE膠中有清晰的條帶。其中有12對顯示早實(shí)枳與普通枳條帶之間有差異，占總結(jié)果的14.5％，反映出基因組

3、重測序及分析準(zhǔn)確率較低;有40對顯示早實(shí)枳與普通枳無差異，但與克里曼丁橘之間有差異，占總結(jié)果的48.2％，說明了枳與橘之間客觀存在的遺傳差異，可為它們之間開發(fā)分子標(biāo)記提供借鑒;
　　3.通過AT克隆測序驗(yàn)證了12個(gè)早實(shí)枳與普通枳存在InDel的差異序列，基因編號為:Pt-21（未知基因）、Pt-35（PP2C型蛋白磷酸酶）、Pt-49(RHC2A型環(huán)指)、Pt-74（抗病蛋白）、Pt-75（抗病蛋白）、Pt-77（類RLP1受體基

4、因）、Pt-81（甲基脂酶）、Pt-83（CCCH鋅指家族）、Pt-84(NAD+，氧化還原酶)、Pt-86(MBD1，甲基化CpG結(jié)合域蛋白1)、Pt-87（未知基因）、Pt-88（未知基因）;
　　4.對3個(gè)重點(diǎn)差異基因進(jìn)行表達(dá)分析。3個(gè)基因分別命名為PtAGO5、PtRZF和PtCCCHZF，以春梢和夏梢自剪前、中、后期頂芽為材料，進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)PtRZF和PtCCCHZF在春梢和夏梢的自剪前、中、后期表達(dá)量逐漸

5、上升，且在早實(shí)枳與普通枳中表達(dá)模式類似，表明這兩個(gè)基因可能參與了柑橘成花轉(zhuǎn)變過程;PtAGO5基因在春梢中的表達(dá)模式與其他兩個(gè)基因類似，但是在夏梢自剪過程中表現(xiàn)出了不一樣的表達(dá)模式，可能與該基因的特異性功能有關(guān);
　　5.對3個(gè)重點(diǎn)差異基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證。分別以早實(shí)枳和普通枳為模板構(gòu)建了6個(gè)超表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化煙草觀察其表型差異?，F(xiàn)已得到分別來自早實(shí)枳和普通枳的PtAGO5基因的轉(zhuǎn)基因煙草T0代植株，但是目前尚未觀察到兩者之間有