早實枳TFL1-CEN同源基因的表達分析及功能特征.pdf

1、童期的發(fā)育機理一直是木本植物育種進程中備受矚目的問題，尤其是對一些具有重要經(jīng)濟價值的林木和收獲果實為目的的果樹來說。如何縮短童期進而提高育種效率,一直是果樹分子生物學(xué)研究的重要課題。20世紀(jì)70年代末在我國宜昌境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一株早花的枳殼突變體，該突變體在播種后第一年就有20％的開花，第三年全部開花，并且可以在一年內(nèi)多次開花。與普通枳相比，其童期大大縮短，正是因為這個特性而被命名為早實枳(precocioustrifoliateorange

2、,Poncirustrifoliata(L.)Raf.)。早實枳短童期階段的特性為研究木本植物童期發(fā)育的分子機理提供了一個寶貴的材料。
　　 早期的果樹成花研究主要集中于生理生化方面，包括環(huán)境因子及栽培技術(shù)措施對實生苗成花的影響等，而對果樹開花的分子機制及其遺傳調(diào)控的研究相對較少。本課題主要對從早實枳中分離的兩個控制木本植物童期發(fā)育的關(guān)鍵基因(PtTFL1和PtTFL2)進行了生物信息學(xué)分析，通過實時定量研究了這兩個基因在不同環(huán)

3、境因子影響下的響應(yīng)，并通過在不同基因型的煙草中表達進行功能驗證。研究主要結(jié)果如下：
　　 1.通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在PtTFL1和PtTFL2的全長序列內(nèi)都存在4個外顯子和3個內(nèi)含子，均編碼一個173個氨基酸讀碼框，預(yù)測的分子量分別為19.5kDa和19.2kDa，等電點分別為9.24和8.79；并在讀碼框內(nèi)均存在1個PEBPmotif,而且在兩個序列內(nèi)，PEBP家族基因的兩個關(guān)鍵位點His88(85位組氨酸)和Asp144

4、(140位天冬氨酸)都保守。在核苷酸水平上與甜橙CiTFL分別有98％和71％的一致性：此外，PtTFL1和PtTFL2在核苷酸序列上有77％一致性。
　　 2.對早實枳通過光周期、GA3和不同的溫度處理后，并通過實時定量檢測了PtTFL1和PtTFL2對這些環(huán)境因子的響應(yīng)。結(jié)果顯示：在短日照和低溫處理后，兩個基因均呈現(xiàn)下降的表達趨勢。而當(dāng)經(jīng)過長日照、GA3和冷處理后，雖然在開花過程中兩個基因的功能相似，但是其表達水平卻呈現(xiàn)了相

5、反的表達模式，可能是這兩個基因在開花過程中的功能是通過不同的調(diào)控模式來實現(xiàn)的，從而導(dǎo)致了對一些因素的響應(yīng)不同。
　　 3.煙草葉片和早實枳莖段對HygB的敏感性檢測結(jié)果顯示：它們都對HygB敏感，結(jié)合本次實驗結(jié)果及考慮到抗生素對外植體的傷害，初步確定NicotianatabacumLinn.葉片在轉(zhuǎn)基因過程中對HygB的篩選壓為5mg/L,Nicotiananudicaulis葉片篩選壓為2.5mg/L，早實枳莖段篩選壓為2.5

6、mg/L，為下一步利用HygB進行篩選轉(zhuǎn)化植株提供依據(jù)。
　　 4.為了研究PtTFL1和PtTFL2的功能特征，分別在兩種煙草N.nudicaulis和N.tabacumLinn.中超表達，通過PCR及RT-PCR鑒定兩種轉(zhuǎn)化煙草發(fā)現(xiàn)，在N.nudicaulis的轉(zhuǎn)化植株中：PtTFL1有27株呈現(xiàn)了陽性，陽性率為90％,PtTFL2有38株呈現(xiàn)了陽性，陽性率為47.5％；PtTFL1和PtTFL2的T0代植株與對照相比，除了

7、2株較野生型早開花，其余均出現(xiàn)了不同程度的晚花，轉(zhuǎn)基因植株平均比野生型晚20d左右開花，轉(zhuǎn)PtTFL1植株比轉(zhuǎn)PtTFL2植株早開花約2d的時間。在N.tabacumLinn.的轉(zhuǎn)化株中：PtTFL1有5株呈現(xiàn)了陽性，陽性率為83.3％,PtTFL2有11株呈現(xiàn)了陽性，陽性率為61.1％；PtTFL1和PtTFL2轉(zhuǎn)化植株均比野生型晚開花，而最初的差異主要表現(xiàn)在腋芽和節(jié)間長度方面，轉(zhuǎn)化PtTFL1的植株莖基部均有大量腋芽發(fā)生，并且節(jié)間短