麻竹2個同源異型盒基因(KNOX)的分子特征及功能研究.pdf

1、竹子是重要的森林資源，因其具有成林快、生物量大等獨(dú)特的優(yōu)勢，所以對竹資源的開發(fā)利用日益增加。同源異型盒基因家族(homeobox gene family)編碼的蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，在生物體形態(tài)建成、模式形成和細(xì)胞命運(yùn)的決定中起著重要的作用。為揭示竹子快速生長的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究以重要的筍材兩用竹種——麻竹(Dendrocalamus latiflorus)為材料，分離節(jié)部發(fā)育調(diào)控相關(guān)的同源異型盒基因，并對其進(jìn)行功能研究，以期從分子水平上揭示

2、同源異型盒基因在竹子節(jié)部形態(tài)建成中的作用，為通過基因工程來實(shí)現(xiàn)對竹子生長發(fā)育的調(diào)控，培育新品種提供理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 第一，基因的克隆及其生物信息學(xué)分析。利用RT-PCR和RACE方法，擴(kuò)增得到2個麻竹同源異型盒基因的全長cDNA序列，分別命名為DlKNOX1和DlKNOX2。DlKNOX1基因的cDNA全長1514 bp，編碼358個氨基酸;DlKNOX2基因的cDNA全長1452 bp，編碼330個氨基酸。蛋

3、白結(jié)構(gòu)分析表明，這2個基因所編碼的氨基酸包含4個結(jié)構(gòu)域:KNOX1區(qū)、KNOX2區(qū)、ELK區(qū)、HOMEOBOX區(qū)，屬于KNOX蛋白。應(yīng)用MEGA4軟件的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明: DlKNOX1和DlKNOX2與單子葉植物的KNOX蛋白聚類到一起，說明與其親緣關(guān)系較近。
　　 第二，基因的組織特異性表達(dá)。利用Real-time PCR技術(shù)分析麻竹KNOX基因在不同組織中的表達(dá)模式。結(jié)果表明:DlKNOX1和DlKNOX2在麻竹的根、幼

4、莖、葉片、葉鞘、節(jié)中均有表達(dá)，且在節(jié)中的表達(dá)量最高。但是這2個基因在不同組織中的表達(dá)量存在著一定的差異，其中DlKNOX1在節(jié)、莖和鞘中表達(dá)量分別是根中表達(dá)量的136.8倍、21.4倍和7.6倍;DlKNOX2在節(jié)、莖和鞘中表達(dá)量分別是根中表達(dá)量的36.6倍、14.5倍和14.2倍。
　　 第三，基因的異位表達(dá)。構(gòu)建植物過量表達(dá)載體pPZP-DlKNOX1和pPZP-DlKNOX2，轉(zhuǎn)化擬南芥，通過卡那霉素抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株

5、。觀察表型可知，轉(zhuǎn)基因植株在表型上出現(xiàn)了一系列明顯不同于野生型的變化，包括:(1)葉型變化，表現(xiàn)為葉片皺縮、葉片螺旋、缺刻葉片、小型葉等;(2)株型變化，表現(xiàn)為植株生長延緩、植株矮化，頂端優(yōu)勢喪失、莖頂端分生組織缺失等現(xiàn)象;(3)花型與開花時間變化，表現(xiàn)為花冠表面皺縮，花冠呈不規(guī)則形狀，開花時間明顯延遲;(4)果莢變化，轉(zhuǎn)基因植株有的一個節(jié)長出2個果莢、有的同側(cè)生長、有的對稱生長等現(xiàn)象。
　　 第四，基因的原核表達(dá)。將編碼麻竹K

6、NOX成熟蛋白的基因序列克隆入載體pMAL-c5X中，獲得含有目的基因的原核表達(dá)載體pMAL-c5X-DlKNOX1和pMAL-c5X-DlKNOX2。分別將表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株(E.coli ER2523)后，進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)。通過優(yōu)化表達(dá)條件，分別在28℃和37℃（0.3 mM IPTG誘導(dǎo)2h）條件下獲得DlKNOX1和DlKNOX2表達(dá)豐度較高的可溶性蛋白，大小分別為82 kD(包含了MBP42.5 kD和DlKNOX1成熟

7、蛋白39.5 kD)、79.4 kD(包含了MBP42.5 kD和DlKNOX2成熟蛋白36.9 kD)，與預(yù)期相符。通過MBP標(biāo)簽親和層析的方法進(jìn)行蛋白純化，使用anti-MBP的單克隆抗體作為一抗進(jìn)行Western blotting分析，在預(yù)測位置發(fā)生陽性反應(yīng)，進(jìn)一步證明獲得了表達(dá)目的蛋白。
　　 基因工程是現(xiàn)代育種的重要手段之一，在林木定向育種中有著廣闊的應(yīng)用前景。本研究獲得的麻竹同源異型盒基因KNOX編碼的蛋白是重要的轉(zhuǎn)