小油桐開(kāi)花控制基因FT-TFL1的克隆及功能初步分析.pdf

1、FT(flowering locus T)/TFL1(terminal flowering1)家族是一類(lèi)能編碼磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP)的基因，在很多植物中被證明參與光周期調(diào)控植物開(kāi)花的過(guò)程。但是在木本植物中這類(lèi)基因的研究還較少。本研究的材料小油桐(Jatropha curcas L.)，屬于大戟科的多年生灌木或小喬木，是一種被廣泛認(rèn)可的優(yōu)良能源植物

2、樹(shù)種。但是目前由于小油桐花期不集中、雌花比例較少以及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致其產(chǎn)量還不能滿(mǎn)足快速發(fā)展的生物柴油產(chǎn)業(yè)的需求，所以如何提高小油桐的產(chǎn)量是亟待解決的問(wèn)題。本研究旨在通過(guò)研究小油桐開(kāi)花控制基因FT/TFL1的功能，明確小油桐的開(kāi)花機(jī)理，以期找到調(diào)控小油桐開(kāi)花習(xí)性的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步的遺傳改良和優(yōu)良品種培育奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，也為木本植物開(kāi)花的分子調(diào)控機(jī)制的研究提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 本研究通過(guò)對(duì)已克隆的雙子葉植物中的FT/

3、TFL1家族基因序列進(jìn)行比對(duì)，在同源性較高的序列區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chainreaction，PCR)、cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)和染色體步移技術(shù)(genome walking)克隆獲得了小油桐FT/TFL1家族的5個(gè)成員，分別命名為JcMFT(mother of FT and TFL1)，JcFT,JcTFL1,JcT

4、FL2和JcTFL3。通過(guò)BLAST分析發(fā)現(xiàn)小油桐FT/TFL1基因家族中的5個(gè)成員與其他植物的FT/TFL1基因家族成員的序列同源性可高達(dá)79％～90％?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明5個(gè)基因結(jié)構(gòu)較保守，都具有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，并且中間兩個(gè)內(nèi)含子的堿基數(shù)目很保守，分別為41bp和62bp，這與其它研究報(bào)道相符。對(duì)這5個(gè)基因的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它們相互間同源性較高，其中JcTFL1與JcTFL2同源性最高，可達(dá)77％。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)

5、果顯示，JcFT/TFL1分屬于3個(gè)亞類(lèi)，即JcMFT屬于MFT-亞類(lèi)，JcFT屬于FT-亞類(lèi)，JcTFL1，JcTFL2和JcTFL3都屬于TFL-亞類(lèi)。同時(shí)，將推導(dǎo)的氨基酸序列與擬南芥FT/TFL1序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明擬南芥FT-亞類(lèi)、TFL-亞類(lèi)和MFT-亞類(lèi)中對(duì)功能起關(guān)鍵作用的保守氨基酸位點(diǎn)或區(qū)域在小油桐FT/TFL1中都能對(duì)應(yīng)地找到。
　　 為了研究JcFT/TFL1基因家族在小油桐中的功能，我們分別分析了這5個(gè)基因

6、的時(shí)空表達(dá)模式。取幼苗植株、成年植株開(kāi)花前期、開(kāi)花期以及結(jié)果期的小油桐不同組織器官為材料，通過(guò)半定量反轉(zhuǎn)錄RCR(reverse transcriptionPCR,RT-PCR)方法分析了不同基因在不同發(fā)育階段以及不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，JcMFT主要在種子中表達(dá)，少量在根中表達(dá)；JcFT除了在成年植株開(kāi)花前期中無(wú)表達(dá)外，在其它發(fā)育階段植株的各個(gè)組織中都有表達(dá)，并且在結(jié)果期植株的莖頂端中達(dá)到最高表達(dá)量;JcTFL1和JcTFL3

7、主要在幼苗和未開(kāi)花植株中的根中表達(dá)，其它組織中幾乎沒(méi)有表達(dá)；JcTFL2的表達(dá)組織與JcFT類(lèi)似，其最高表達(dá)量也出現(xiàn)在結(jié)果期植株的莖頂端中。同時(shí)，本研究通過(guò)染色體步移方法克隆出了JcMFT的啟動(dòng)子序列，對(duì)其啟動(dòng)子序列中順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子中含有種子特異性表達(dá)元件RY repeat motif(CATGCAT)和EBOX(CANNTG)，這與半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)的JcMFT在種子中大量表達(dá)結(jié)果相一致。為了進(jìn)一步明確小油桐J

8、cFT/TFL1家族的功能，本研究構(gòu)建了這5個(gè)成員的植物超量表達(dá)載體，然后通過(guò)花浸泡法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。通過(guò)卡那霉素抗性培養(yǎng)基篩選及PCR鑒定獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株，其中獲得JcMFT轉(zhuǎn)基因植株19株，JcFT轉(zhuǎn)基因植株35株，JcTFL1轉(zhuǎn)基因植株4株，JcTFL2轉(zhuǎn)基因植株22株，JcTFL3轉(zhuǎn)基因植株4株。表型觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型擬南芥相比，超量表達(dá)JcFT基因的擬南芥顯著提前開(kāi)花；轉(zhuǎn)35S∷JcTFL2和的擬南芥表現(xiàn)為晚花并且其蓮