油桐LACS基因的克隆及表達(dá)研究.pdf

1、油桐種子制取的油脂稱為桐油，桐油中富含三價(jià)不飽和脂肪酸桐酸，是一種十分重要的工業(yè)原料，具有很高的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。油桐脂肪酸的合成是一個(gè)復(fù)雜的生物代謝過程，由許多酶促反應(yīng)共同催化。長鏈脂酰輔酶A合成酶(LACS)參與脂肪酸的合成和分解，參與磷脂、茉莉酸和三?；视偷暮铣桑矃⑴c了脂肪酸的β-氧化?；贚ACS在脂肪酸合成中的關(guān)鍵作用，揭示LACS在油桐油脂合成中的功能、作用和規(guī)律對(duì)于油桐的育種意義重大。本論文主要開展了油桐長鏈脂酰輔酶A合成

2、酶基因的克隆、基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)研究，主要的研究結(jié)果如下:
　　1.油桐LACS1、LACS4、LACS8基因的cDNA克隆及生物信息學(xué)分析?；诒緦?shí)驗(yàn)室油桐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以葡萄桐為實(shí)驗(yàn)材料，設(shè)計(jì)特異引物，運(yùn)用PCR技術(shù)克隆得到3個(gè)油桐長鏈脂酰輔酶A合成酶基因的全長cDNA序列，并分別命名為LACS1、LACS4、LACS8。其中，LACS1基因cDNA全長為1983bp，ORF為1983bp，編碼660個(gè)氨基酸，預(yù)測分析顯示蛋白質(zhì)

3、分子量為74.59 kDa，等電點(diǎn)pI為6.07，GenBank登錄號(hào)為KT921224; LACS4基因cDNA全長為1989bp，ORF為1989bp，編碼662個(gè)氨基酸，預(yù)測分析顯示蛋白質(zhì)分子量為73.79 kDa，等電點(diǎn)pI為6.60，GenBank登錄號(hào)為KP996689; LACS8基因cDNA全長為2199bp，ORF為2199bp，編碼732個(gè)氨基酸，預(yù)測分析顯示蛋白質(zhì)分子量為80.5kDa，等電點(diǎn)pI為7.46，Gen

4、Bank登錄號(hào)為KT362743。
　　2.油桐LACS1、LACS8基因的基因組DNA克隆。以葡萄桐葉片組織DNA為模板，分別設(shè)計(jì)兩個(gè)基因的特異引物，分別克隆出LACS1和LACS8的基因組序列。其中LACS1基因組全長4783bp，LACS8基因組全長5191bp，將兩個(gè)基因的cDNA序列與基因組序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組剪切分析表明，LACS1基因組有18個(gè)內(nèi)含子，LACS8基因組有10個(gè)內(nèi)含子。
　　3.油桐LACS基因的時(shí)空表

5、達(dá)及油脂積累相關(guān)性分析。通過熒光定量PCR技術(shù)檢測了LACS1、LACS4和LACS8基因在油桐組織和不同發(fā)育時(shí)期種子中的相對(duì)表達(dá)量，LACS1基因在莖和葉中的表達(dá)水平相對(duì)較高，在老葉中表達(dá)量最高，在種子發(fā)育的8月15日表達(dá)水平達(dá)到峰值;LACS4基因在花和老莖中的表達(dá)量相對(duì)較高，特別是在雄蕊中表達(dá)量最高，在發(fā)育的種子中10月10日出現(xiàn)了表達(dá)高峰;LACS8基因在雌蕊中的表達(dá)量最高，在種子發(fā)育的9月20日到10月20日表達(dá)量逐漸升高，且

6、在10月20日達(dá)到最大。
　　桐油的生物合成呈“S”型曲線，8月份到10月份為桐油油脂合成高峰期，LACS8基因表達(dá)量和油桐種子含油率關(guān)聯(lián)分析表明該基因可能參與油桐脂肪酸的合成。
　　4.油桐LACS4基因的真核表達(dá)。構(gòu)建油桐LACS4基因的真核超表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S-LACS4，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，采用花粉管通道法侵染擬南芥，抗性培養(yǎng)基篩選陽性植株后提取DNA，利用超表達(dá)載體中的潮霉素基因擴(kuò)增驗(yàn)證