枳兩個基因PtrABF和PtrCDPK轉化枳的抗逆功能及其作用機制解析.pdf

1、柑橘在生長發(fā)育的過程中易受到各種逆境脅迫，因此會對柑橘產業(yè)產生影響。為解決這些問題必須加強培育抗性強的柑橘品種。傳統(tǒng)的育種手段對于果樹育種來說，需要的周期長，局限性較大，而隨著基因工程技術的應用，將一些具有抗性的基因轉入柑橘中將加快柑橘育種的進程。枳（Poncirus trifoliata）是柑橘中廣泛應用的砧木之一，具有較強的抗寒性。已有研究表明，ABF和CDPK能被逆境誘導表達，參與逆境響應調控。本研究利用超表達PtrABF和Ptr

2、CDPK早實枳，進一步分析了它們的基因功能及其作用機理，研究結果如下:
　　1、對PtrABF基因轉早實枳株系進行PCR鑒定，獲得6株陽性轉基因植株。PtrABF基因在＃8和＃10株系中超量表達。試驗結果顯示，轉基因株系較野生型有較強的抗脫水能力。掃描電鏡觀測顯示轉基因植株的氣孔密度和開度較野生型降低。RT-PCR顯示氣孔發(fā)育相關基因SPCH、FAMA和MUTE在轉基因株系中表達量下降。PtrICE1是氣孔發(fā)育的關鍵基因，利用酵母

3、雙雜交和BiFC技術表明PtrABF能與PtrICE1互作。
　　對正常條件下的野生型和＃10系進行基因芯片雜交，共挑選出70個差異表達基因，其中上調表達42個，下調表達28個。隨機挑選了10個上調表達基因進行了RT-PCR驗證與芯片結果一致。在上調表達的42個差異基因中，33個差異基因有功能注釋。并分析了33個上調表達的差異基因的啟動子中的ABREs(ABA-responsive elements)和CEs(coupling e

4、lements)順式作用元件。33個上調表達的差異基因中，大部分啟動子中僅包括ABREs、CEs或二者的組合式順式作用元件，只有5個不含有ABREs或CEs順式作用元件。
　　基因芯片分析顯示，PtPOD和PtADC的轉錄水平在轉基因系（＃10和＃8）中表達高于野生型(WT)。酵母單雜交和瞬時表達進一步驗證了PtrABF能與PtADC和PtPOD啟動子互作。轉基因系中POD酶活性在脫水處理前后是野生型的大約2倍，脫水處理后，在轉基

5、因株系中POD、CAT、SOD酶活性均高于野生型，此結果與其基因表達量一致。ROS結果顯示轉基因葉片中H2O2和O2-的含量均顯著低于野生型，與DAB和NBT的染色結果一致。此外，轉基因系中MDA含量顯著低于野生型，與較低ROS積累結果一致。正常生長條件下的轉基因系中的自由態(tài)多胺（腐胺、精胺、亞精胺）均高于野生型。不同濃度的D-arg(ADC抑制劑)預處理轉基因株系，脫水處理后，轉基因株系中H2O2和O2-的積累和含量隨著D-arg濃度

6、的增加而增加。不同濃度的雙胍辛胺乙酸鹽預處理后再進行脫水處理，結果顯示，隨著雙胍辛胺乙酸鹽濃度的增加，轉基因系中H2O2的積累較野生型少，且轉基因株系中抗氧化物酶的基因表達和酶活性也比野生型降低。
　　2、PtrCDPK編碼一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，開放讀碼框含有1676bp堿基，編碼558個氨基酸，該蛋白的分子量為63.25 kDa，等電點為8.26。PtrCDPK的催化區(qū)含有1個保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結合區(qū)和調控區(qū)含有4個

7、EF手型結構鈣結合區(qū)，氨基酸比對顯示與其他物種的相似性較高。與擬南芥CDPK家族進行進化樹分析顯示PtrCDPK被劃分為第Ⅲ族成員。PtrCDPK能響應多種脅迫如ABA、干旱、鹽等，并定位于細胞核和細胞膜上。對PtrCDPK基因轉早實枳株系進行PCR鑒定，獲得4株陽性轉基因植株。PtrCDPK基因在＃34和＃36株系中超量表達。轉基因植物具有較強的抗脫水能力，轉基因植物的相對失水率、電導率、MDA含量均低于野生型。轉基因株系積累較少的R