枳精氨酸脫羧酶基因(PtADC)轉(zhuǎn)化煙草提高抗脫水研究.pdf

1、多胺是生物體在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿，廣泛存在于植物體內(nèi)，在逆境脅迫中對(duì)植物具有保護(hù)作用。多胺主要有腐胺、精胺和亞精胺三種類型，其中精氨酸脫羧酶(ADC)是多胺合成中的關(guān)鍵酶之一，催化精氨酸脫羧生成鯡精胺(Agm)，然后再由鯡精胺水解生成生成腐胺。本試驗(yàn)采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將枳精氨酸脫羧酶基因(PtADC)轉(zhuǎn)化到煙草中，并對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因材料的抗性進(jìn)行分析，主要結(jié)果有：
　　 1.PCR檢測(cè)及半定

2、量分析：PtADC基因表達(dá)載體通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，共獲得12棵生根的抗性苗，以轉(zhuǎn)基因煙草的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)，以含目的基因的菌液質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以ADCR+35SF和NPTⅡ引物均能擴(kuò)增出特異的DNA片段，而野生型煙草植株未擴(kuò)增出片段，說(shuō)明pBI121-PtADC基因片段已經(jīng)轉(zhuǎn)入煙草基因組中；取其中的2株轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行半定量RT-PCR分析，結(jié)果表明PtADC基因在煙草中表達(dá)。
　　 2.轉(zhuǎn)基因煙

3、草中腐胺含量測(cè)定：取2個(gè)超表達(dá)PtADC的T2株系進(jìn)行脫水處理，然后進(jìn)行腐胺的測(cè)定，結(jié)果表明脫水處理前和處理后，轉(zhuǎn)基因煙草中腐胺含量都比對(duì)照的含量高。
　　 3.轉(zhuǎn)基因煙草離體苗的相對(duì)失水率：取播種60d的轉(zhuǎn)基因和對(duì)照離體苗葉片，在室溫下進(jìn)行脫水處理，然后測(cè)定相對(duì)失水率。結(jié)果表明：脫水處理之后對(duì)照的相對(duì)失水率比轉(zhuǎn)基因高，隨著脫水時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照葉片較轉(zhuǎn)基因葉片嚴(yán)重萎蔫。
　　 4.離體苗的相對(duì)電導(dǎo)率和葉片的相對(duì)溫度：測(cè)定

4、離體葉片在脫水處理前后的電導(dǎo)率和葉片相對(duì)溫度，結(jié)果顯示，在未處理時(shí)轉(zhuǎn)基因材料和對(duì)照之間相對(duì)電導(dǎo)率的差異很小，而處理之后轉(zhuǎn)基因材料的電導(dǎo)率低于對(duì)照，轉(zhuǎn)基因葉片處理前后的相對(duì)溫度都比對(duì)照的高。
　　 5.離體苗的染色：葉片在脫水處理時(shí)會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子和過(guò)氧化氫，對(duì)轉(zhuǎn)基因材料葉片和對(duì)照葉片進(jìn)行DAB和NBT染色觀察。結(jié)果表明：脫水處理前，轉(zhuǎn)基因葉片和對(duì)照葉片之間差異很??；而處理之后，對(duì)照的顏色比轉(zhuǎn)基因深，暗示了葉片中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫和超