米糠谷氨酸脫羧酶的分離純化及其性質(zhì)研究.pdf

1、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)作為一種非蛋白質(zhì)氨基酸，具有許多重要的生理功能，谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)可催化L-谷氨酸脫羧生成GABA，利用植物內(nèi)源性GAD制備GABA是一個很好的途徑。研究發(fā)現(xiàn)，米糠具有較高的GAD活力。本論文從米糠中分離純化得到GAD和對其活性有重要意義的鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)，對它們的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行

2、研究，探討米糠中GAD的活性調(diào)節(jié)機(jī)制，為進(jìn)一步利用米糠GAD富集制備GABA提供理論基礎(chǔ)。
　　 論文首先研究了植物組織中GAD活力的測定方法。建立了2，4-二硝基氟苯(FDNB)柱前衍生反相高效液相色譜-紫外檢測法測定植物中GAD活力的方法。利用GAD催化L-谷氨酸脫羧轉(zhuǎn)變成GABA的性質(zhì)，用FDNB柱前衍生GABA，HPLC Lichrospher C18色譜柱分離，在360nm下檢測衍生物，從而得到生成GABA的含量，及不

3、同植物組織中的GAD活力。該方法的線性范圍0.2-5mg/mL GABA(R2=0.9954)，精密度高(RSD=0.061%)，回收率高，且衍生化產(chǎn)物在一個月內(nèi)都能保持穩(wěn)定。本方法成功地應(yīng)用于幾種植物組織的GAD活力測定。結(jié)果顯示，米糠具有相對較高的GAD活性，利用廉價易得的米糠制備GABA具有良好的前景。
　　 在對粗提物進(jìn)行(NH4)2SO4分級沉淀后，分別采用色譜方法(包括：DEAE-SephroseFF離子交換色譜、H

4、W-55F體積排阻色譜和Superdex200凝膠過濾色譜)和Native-PAGE法分離純化得到了米糠中兩種GAD同工酶：RbGADL1和RbGADL3。SDS-PAGE結(jié)果顯示為單一條帶，根據(jù)Rf值計算得到其相對分子質(zhì)量分別為：7.3萬和4.7萬，質(zhì)譜(MS)法測得RbGADL1和RbGADL3的相對分子質(zhì)量分別為139113.97和46985.65。推測RbGADL1是由兩個相對分子質(zhì)量約70000的亞基組成的，而RbGADL3不

5、含有亞基。本論文選擇回收率較高的RbGADL3進(jìn)行結(jié)構(gòu)和性質(zhì)方面的研究。
　　 分別用肽指紋圖譜法(PMF)和肽序列標(biāo)簽技術(shù)(PSI)對RbGADL3進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示其與Os01g0926300的肽指紋圖譜最為相似，肽段覆蓋率為22.69%。PSI-BLAST同源性分析表明RbGADL3與Os0390113700(Oryza sativa(japonica cultivar-group))和OsI_09713(Oryza sa

6、tiva Indica Group)同源性較高。通過紫外-可見、熒光、圓二色(CD)光譜、傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜(FT-IR)、拉曼光譜(Raman)等光譜學(xué)性質(zhì)研究，并結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測方法，得到了RbGADL3二級結(jié)構(gòu)的大致范圍：α-螺旋含量約為30%-45%；β-折疊含量約為10%-20%，β-片層含量約為10%-30%，無規(guī)卷曲含量約為30%-60%。用同源模擬法和折疊識別模擬方法來預(yù)測RbGADL3的空間結(jié)構(gòu)，得到了RbGADL3

7、大致的結(jié)構(gòu)模型。
　　 利用Phenyl Sepharose CL-4B疏水層析一步純化得到了米糠中的CaM: RbCaM，純化倍數(shù)為851.7，比活力7.66U/mg，回收率為55.6%。MS測定RbCaM的相對分子質(zhì)量17221.89，氨基酸分析結(jié)果顯示，RbCaM中酸性氨基酸含量豐富，堿性氨基酸的比例較低，不含色氨酸。
　　 分別用PMF法和PSI法對RbCaM進(jìn)行鑒定，得到相同的結(jié)果為Os0390699000(o

8、leosin，Oryza sativa Japonica Group)，為來源于稻米的一種儲存蛋白質(zhì)。并研究了Ca2+存在與否兩種情況下RbCaM的紫外-可見、熒光和CD光譜性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)RbCaM結(jié)合Ca2+前后結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，并通過CD光譜研究其二級結(jié)構(gòu)。與生物信息學(xué)方法結(jié)合，推斷出RbCaM二級結(jié)構(gòu)的大致范圍：α-螺旋含量約為30%-50%；β-折疊含量約為0%-10%，β-片層含量約為0%-30%，無規(guī)卷曲含量約為27%-44

9、%。在同源模擬法預(yù)測RbCaM三級結(jié)構(gòu)失敗的情況下，通過折疊識別模擬方法識別到以下幾個折疊區(qū)域模型：Neurotransmitter-gated ion-channel transmembrane pore(神經(jīng)傳遞離子通道轉(zhuǎn)膜孔)、Transmembrane helix hairpin(轉(zhuǎn)膜發(fā)卡螺旋)、Ribosomal protein L13(核糖體蛋白L13)和Signaling protein(信號傳遞蛋白)。PredictPr

10、otein服務(wù)器預(yù)測結(jié)果顯示，RbCaM為一個結(jié)構(gòu)致密的球狀蛋白質(zhì)。位點比對搜索結(jié)果顯示，RbCaM可能具有以下三個位點：Protein kinase C phosphorylation site、N-myristoylation site和Oleosins signature。
　　 研究了RbGADL3的酶學(xué)性質(zhì)以及RbCaM對RbGADL3活力的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)RbCaM對RbGADL3起激活作用，在Ca2+存在條件下，激活

11、作用大大提高。并且發(fā)現(xiàn)主要起激活作用的是Ca2+，而不是其他金屬離子。證明RbGADL3也是一種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，而且是一種Ca2+依賴的CaMBP，其活性受Ca2+調(diào)節(jié)。在Ca2+濃度為0.23mmol/L條件下，1mg RbGADL3的半激活RbCaM量為6μg。
　　 優(yōu)化了利用米糠內(nèi)源GAD富集制備GABA的工藝。得到最佳富集條件：反應(yīng)時間6h，0.08mol/L的磷酸鹽緩沖液，PLP濃度2mmol/mol谷氨酸鈉(MSG

12、)，Ca2+濃度20mmol/mol MSG，米糠用量500g/molMSG。該條件下GABA的生成量為2.3g/100g米糠，這個含量是其本身所含有GABA的45倍。并利用海藻酸鈉固定化米糠GAD，制備出操作穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性都比未固定米糠(FRB)大大提高的固定化米糠(IRB)，設(shè)計了連續(xù)化生產(chǎn)GABA的工藝，為GABA的制備提供了新的途徑。在最佳條件下反應(yīng)60h后，GABA的產(chǎn)量25.98mg/g米糠，比FRB法GABA產(chǎn)量高12