短乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）是一類磷酸吡哆醛依賴性酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，不僅能催化谷氨酸脫羧產(chǎn)生γ-氨基丁酸，而且還可作為診斷型酶制劑用于Ⅰ型糖尿病的診斷。γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyricacid或γ-Aminobutanoicacid，簡稱GABA），又稱4-氨基丁酸、氨酪酸，是一種非蛋白氨基酸，廣泛分布于動(dòng)植物體內(nèi)，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，具有重要的生理

2、功能。本課題組經(jīng)選育得到了一株γ-氨基丁酸高產(chǎn)菌株，從形態(tài)學(xué)上初步判定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），其γ-氨基丁酸的最大產(chǎn)量已達(dá)到76.4g/L。本文對該菌的谷氨酸脫羧酶基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)，以用于GABA的制備和GAD酶學(xué)性質(zhì)的研究及應(yīng)用。
　　 論文對上述γ-氨基丁酸高產(chǎn)菌株的16s rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序，對該菌進(jìn)行菌種鑒定，在此基礎(chǔ)上利用GenBank對已有全長序列的親緣相近的乳酸菌的GAD

3、基因進(jìn)行了收集和分析，根據(jù)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)了一系列簡并引物。在提取該γ-氨基丁酸高產(chǎn)菌株的基因組后，分別采用不同的上下游引物在不同PCR條件下進(jìn)行了GAD基因的擴(kuò)增，最終得到了長度約為1407bp、1440bp和1881bp的三個(gè)核酸片斷，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)三個(gè)片斷大小分別與已有乳酸菌GAD基因相當(dāng)。分別連接T-A克隆載體后測序，分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個(gè)片斷均分別與已報(bào)道的谷氨酸脫羧酶基因高度近似且具有GAD的保守序列，證明所得PCR產(chǎn)物均為GAD

4、編碼基因。
　　 以pET-28a(+)為載體，使用限制性內(nèi)切酶分別將三個(gè)GAD基因片段從T-A克隆載體上酶切并切膠回收，經(jīng)過優(yōu)化酶切、回收純化和連接條件，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，經(jīng)篩選，得到表達(dá)GAD的工程菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-GAD1407,E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-GAD1440,和E.coliBL21(DE3)-pET-

5、28a(+)-GAD1881。通過對誘導(dǎo)表達(dá)條件的調(diào)整，實(shí)現(xiàn)了GAD1407和GAD1440的胞內(nèi)可溶表達(dá)，并測定了GAD1407的谷氨酸脫羧活性。
　　 研究了影響重組工程菌E.coliBL21(DE3)-pET28α(+)-GAD1407生長的培養(yǎng)基組成，采用合成培養(yǎng)基二次發(fā)酵誘導(dǎo)的方法提高了重組蛋白的胞內(nèi)可溶表達(dá)量，并考察了影響重組酶表達(dá)水平的誘導(dǎo)條件（誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)后培養(yǎng)時(shí)間）等。采用Ni-NTA親和純化方法