固定化谷氨酸脫羧酶的制備與酶學性質(zhì)研究.pdf

1、γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，簡稱GABA）是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑，對人體具有鎮(zhèn)靜安神、促進睡眠、改善免疫功能等作用，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值，由生物方法制備的GABA已被我國衛(wèi)生部列為“新資源食品”。生物體內(nèi)的GABA由谷氨酸脫羧酶（glutamatede carboxylase，簡稱GAD）催化谷氨酸脫羧生成，因此GAD是GABA生物制備的關(guān)鍵酶。為了提高GABA生物制備方法的效率和

2、競爭力，本文以利用固定化GAD進行GABA的生物制備為目標，分別采用凝膠包埋法和金屬螯合方法進行了GAD的固定化，考察了固定化條件對固定化酶性能的影響，優(yōu)化了固定化條件，測定了所得固定化酶的底物親和強度、最適催化條件和操作穩(wěn)定性等關(guān)鍵性質(zhì)，為利用固定化GAD進行GABA的生物制備創(chuàng)造了條件。具體研究內(nèi)容如下：
　　 對聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，簡稱PVA）-海藻酸鈉（sodium alginate，簡稱SA）

3、固定化GAD的條件進行了研究。分別考察了PVA濃度和SA濃度對凝膠顆粒直徑、機械強度以及固定化后酶活力保留的影響；PVA和SA比例對固定化后酶活力保留的影響；PVA-SA與GAD酶液比例對固定化酶催化活力和酶活回收率的影響；以及CaCl2濃度對固定化后GAD酶活力的影響。研究表明，當PVA濃度為9％，SA濃度為2.5%，PVA:SA(W/W)為70:30，PVA-SA:GAD(W/V)為6：1，CaCl2濃度為1%時能獲得機械強度好，酶

4、活回收率最高的固定化GAD凝膠顆粒。在上述優(yōu)化的條件下，考察了固定化GAD的各項酶學性質(zhì),并與游離酶加以比較。同時，測定了固定化后GAD的表觀動力學參數(shù)，評估了PVA-SA包埋法固定化GAD的操作穩(wěn)定性。研究表明，GAD的最適催化溫度與游離酶相同為50C;最適催化pH向堿性方向略有改變?yōu)閜H4.8;熱穩(wěn)定性最強的溫度為45℃，比游離酶高了10C;酸堿穩(wěn)定性最好的pH為5.2，在實驗設(shè)定的pH范圍內(nèi)，固定化GAD的穩(wěn)定性大大高于游離酶；K

5、m為13.6mmol/L;連續(xù)催化7次以后，固定化GAD酶活力仍然保持在初始值的87%左右，說明PVA-SA法制備的固定化GAD凝膠顆粒操作穩(wěn)定性好，具有很好的應(yīng)用前景。
　　 利用親和層析介質(zhì)Ni-NTA對GAD進行了固定化，并測定了固定化后的各項酶學性質(zhì)，動力學參數(shù)，考察了其操作穩(wěn)定性。Ni-NTA親和固定化GAD的最佳投料濃度為0.6mg/mL;最適催化溫度與游離酶相同為50℃；最適pH向堿性方向略有改變?yōu)閜H4.8;酸堿