干旱對玉米雌雄穗基因表達的影響和谷氨酸脫羧酶基因的克隆與分析.pdf

1、玉米不僅是重要的糧食和飼料作物，也是重要的食品工業(yè)原料和能源植物。玉米是我國第二大糧食作物，玉米生產(chǎn)在我國國民經(jīng)濟中占有十分重要的地位。我國有60％的玉米種植面積受到干旱脅迫，每年因旱災(zāi)而減產(chǎn)20％～30％，直接影響國民經(jīng)濟發(fā)展及災(zāi)區(qū)人民生活。在玉米的生育期中，從孢子母細(xì)胞到受精和種子形成的早期階段對包括干旱脅迫在內(nèi)的各種脅迫最為敏感，其中有兩個敏感高峰期：第一個是從減數(shù)分裂到四分體時期，這期間的脅迫可引起配子的不正常發(fā)育；第二個高峰期

2、是從開花到籽粒發(fā)育的起始，這期間的脅迫可影響授粉或受精，誘導(dǎo)了花的脫落或新形成籽粒的敗育。因此搞清楚干旱對開花期玉米的傷害及玉米在此期對干旱的適應(yīng)和調(diào)節(jié)機制，對于培育抗旱玉米品種具有重要意義，也是國內(nèi)外學(xué)者們關(guān)注的重要課題之一。 要探索某一植物對某種脅迫所產(chǎn)生的應(yīng)答，需要對脅迫應(yīng)答的基因表達變化有一個整體的認(rèn)識。由于基因芯片具有一次可以同時分析成千上萬基因表達的強大優(yōu)勢，近年來已被用來分析多種植物在多種脅迫或刺激下的基因表達譜。

3、對擬南芥在干旱、冷、鹽、強光、損傷、氧化、紫外線等脅迫下的表達譜分析已有較多報道。利用芯片技術(shù)研究水稻和其它作物在脅迫條件下基因表達變化的工作也報道較多。 玉米在逆境下的基因表達譜研究已有較多的報道。在干旱脅迫下，玉米幼苗葉片和根有著不同的基因表達模式，一個乙烯信號途徑可能參與了玉米對干旱的反應(yīng)。在鹽脅迫處理3h時玉米根的轉(zhuǎn)錄組變化最為劇烈，這些表達變化的基因中最為顯著的是參與運輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因。對抽絲前和抽絲后雌穗在遮陰

4、脅迫下的基因表達研究發(fā)現(xiàn)，參與ABA信號途徑的基因表達上調(diào)；參與淀粉合成的基因表達下調(diào)，而參與淀粉降解的基因表達沒有變化。對抽絲后未受粉的雌穗和授粉后8天的籽粒在缺水脅迫下的基因表達譜研究發(fā)現(xiàn)，不同的組織對脅迫的敏感程度不同，共有17個基因在不同的組織中都呈現(xiàn)差異表達，這些基因參與廣泛的生物學(xué)反應(yīng)。對授粉后15天的玉米籽粒在干旱和鹽脅迫下的基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)，在這兩種脅迫下都上調(diào)表達的基因主要是參與非生物脅迫、損傷和病菌侵染的應(yīng)答基因，

5、而共同表達下調(diào)的主要是參與能量代謝的基因。從以上結(jié)果來看，芯片表達譜的研究主要集中在玉米苗期和在生殖期中對脅迫敏感的第二高峰期，而在玉米生殖期對干旱脅迫敏感的第一個高峰期的基因組表達譜研究未見報道。本實驗以處于對干旱敏感的第一高峰期的雄穗和處于小花分化期的雌穗為材料，利用玉米基因組芯片(microarray)檢測了雌雄穗在玉米植株受到缺水脅迫1天和7天時的基因表達譜。該芯片包含了57452個轉(zhuǎn)錄本，代表了3萬多個基因。我們以處理和對照樣

6、品的信號值的比值不低于3倍的轉(zhuǎn)錄本為有意義的差異表達轉(zhuǎn)錄本。經(jīng)過1天的缺水脅迫，雌穗中表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本有70個，表達下調(diào)的有89個(占差異表達轉(zhuǎn)錄本的56％)；在雄穗中表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本有191個，表達下調(diào)的有681個(占差異表達轉(zhuǎn)錄本的78％)。在7天的缺水脅迫下雌穗中表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本有169個，表達下調(diào)的有33個，表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本占差異表達轉(zhuǎn)錄本的84％；在雄穗中表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本有939個，表達下調(diào)的有574個，表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本占差異

7、表達轉(zhuǎn)錄本的62％。在雌雄穗中差異表達的轉(zhuǎn)錄本共有2552個。雌雄穗的表達譜差異較大。在雌雄穗中都表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本有73個，都表達下調(diào)的有17個。通過對這些差異表達的轉(zhuǎn)錄本的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)參與代謝的轉(zhuǎn)錄本的比例最大，其中比較突出的是參與蔗糖、棉子糖和海藻糖代謝途徑的轉(zhuǎn)錄本。另外，在雄穗中參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞壁代謝的轉(zhuǎn)錄本也占據(jù)了相當(dāng)大的比例。這些差異表達的基因可能是對缺水脅迫的應(yīng)答基因。 利用來自葉片差減文庫的514個單一(

8、unique)ESTs制作了尼龍膜cDNA宏陣列(macroarray)，研究了在缺水脅迫下這些ESTs在雌雄穗中的表達變化。以處理和對照樣品的信號值的比值不低于3倍的ESTs為有意義的差異表達ESTs。在1天和7天缺水脅迫下，雌穗中表達上調(diào)的ESTs分別有58和106個；雄穗中表達上調(diào)的ESTs分別有79和151個。在雌雄穗中表達上調(diào)的ESTs共有222個。對這222個ESTs進行功能分類分析，發(fā)現(xiàn)參與代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的ESTs占據(jù)了主

9、要份額，這與芯片的實驗結(jié)果相一致。我們把這222個ESTs與玉米芯片上oligo所代表的序列進行比對，序列相匹配的有184個，約占82％，其中有125個在芯片和宏陣列實驗中都表現(xiàn)上調(diào)，約占68％。表明這兩個檢測試驗的結(jié)果一致性較好。在用玉米基因組芯片和宏陣列進行的檢測試驗中都出現(xiàn)一個受干旱脅迫誘導(dǎo)表達的候選谷氨酸脫羧酶(GAD)基因，我們克隆了該基因的cDNA全長，并在大腸桿菌中實現(xiàn)表達。通過對融合蛋白酶活性分析，證明該基因的確為谷氨酸

10、脫羧酶基因，命名為ZmGAD1。序列分析表明，ZmGAD1編碼蛋白具有谷氨酸脫羧酶保守的兩個結(jié)構(gòu)域，即序列中部的磷酸吡哆醛(PLP)結(jié)合位點和C端的鈣調(diào)素(CaM)結(jié)合位點。Southern blotting分析表明，該基因在基因組中存在一個拷貝。利用相似性搜索獲得了ZmGAD1的基因組基因序列，并發(fā)現(xiàn)ZmGAD1基因定位在1號染色體上，由7個外顯子和6個內(nèi)含子組成。利用電子克隆，獲得了玉米中谷氨酸脫羧酶基因的另一個成員全序列，命名為Z

11、mGAD2。序列分析發(fā)現(xiàn)ZmGAD2的C端沒有結(jié)合CaM的結(jié)構(gòu)特點。分析ZmGAD2的基因組基因序列，發(fā)現(xiàn)ZmGAD2基因定位在2號染色體上，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成。ZmGAD1和ZmGAD2分別與水稻OsGAD1和OsGAD2的進化關(guān)系較近，而且它們的基因組基因的結(jié)構(gòu)特點相似，推測它們可能是不同物種中的直向同源基因(orthologs)。表達譜分析表明，ZmGAD1在根、葉片、莖、雌穗和雄穗中都有表達，在雌穗中表達強度最高，在葉

12、片中表達強度最低。在PEG、鹽、冷、ABA和MeJA處理下，玉米苗期的葉片中ZmGAD1呈現(xiàn)上調(diào)表達；在根中，ZmGAD1的表達變化與其在葉片中有差異。分析克隆的ZmGAD1編碼區(qū)的上游序列，發(fā)現(xiàn)含有較多的脅迫應(yīng)答元件，如ABRE等，表明ZmGAD1基因的表達受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。測定脅迫下玉米葉片和根GAD酶活性，發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的延長，GAD的酶活性持續(xù)升高，與該基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化不完全一致，推測ZmGAD1的酶活性也受翻譯后調(diào)節(jié)。