苦豆子賴氨酸脫羧酶基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、賴氨酸脫羧酶（Lysine Decarboxylase，LDC）基因是苦豆子（Sophora alopecuroidesL.）苦參堿（Matrine，MA）和氧化苦參堿（Oxymatrine，OMA）生物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶基因，在其生化代謝過程中起著重要的作用。本研究以西北特有中藥材苦豆子為材料，克隆其賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)和啟動(dòng)子序列，分析不同苦豆子居群賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)序列多樣性，挖掘與OMA含量相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，探討該基

2、因表達(dá)與MA和OMA含量的關(guān)系，驗(yàn)證其啟動(dòng)子的功能，旨在揭示賴氨酸脫羧酶基因的功能，為通過遺傳工程等手段培育高M(jìn)A和OMA含量的苦豆子奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:
　　(1)采用同源克隆技術(shù)從苦豆子中分離得到長(zhǎng)度為1368bp的DNA片段，經(jīng)測(cè)序、BLAST驗(yàn)證為賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)序列，命名為SaLDC（登錄號(hào):KM249871）。生物信息學(xué)分析表明，苦豆子賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)與苦參（Sophora flavescens）和狗苦

3、參（Echinosophorakoreensis）賴氨酸脫羧酶基因序列一致性高達(dá)97％，該基因共編碼455個(gè)氨基酸殘基，蛋白質(zhì)分子量49.14KD，屬于PLPDEⅢ超基因家族。在氨基酸序列中找到了產(chǎn)喹諾里西啶類生物堿(Quinolizidine Alkaloids，QAs)植物的賴氨酸脫羧酶蛋白的特征性保守位點(diǎn)Phe340。聚類結(jié)果顯示，苦豆子與產(chǎn)QAs的植物聚為一個(gè)大類。
　　(2)采用染色體步移技術(shù)，先后分別獲得約800bp和

4、1500bp的DNA片段，經(jīng)測(cè)序、拼接后獲得長(zhǎng)度為1948bp的苦豆子賴氨酸脫羧酶基因啟動(dòng)子片段。生物信息學(xué)分析該基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可能位于起始密碼子上游45bp處，其核心啟動(dòng)子元件TATA box和CAAT box分別位于-27bp和-81bp處。在啟動(dòng)子區(qū)域存在有大量的與光響應(yīng)、逆境防御應(yīng)答、激素響應(yīng)、組織特異性表達(dá)相關(guān)的順式作用元件，推測(cè)苦豆子賴氨酸脫羧酶在生命活動(dòng)過程中較為活躍，能夠行使復(fù)雜的生物學(xué)功能。
　　(3)對(duì)16個(gè)

5、苦豆子居群賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)序列多樣性研究表明，該基因中間部分較為保守，變異主要存在與5'端和3'端。在16個(gè)苦豆子居群賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)中共找到35個(gè)SNP，其中同義突變13個(gè)，錯(cuò)義突變22個(gè)，SNP發(fā)生頻率為1SNP/39.08bp。Tajima'D值檢測(cè)和Ka/Ks結(jié)果顯示，16個(gè)居群苦豆子賴氨酸脫羧酶基因編碼區(qū)進(jìn)化不符合中性模型，受負(fù)向選擇作用。將SNP位點(diǎn)與氧化苦參堿含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共找到6個(gè)有價(jià)值的突變位點(diǎn)，可用于

6、篩選高含量氧化苦參堿苦豆子的Caps引物開發(fā)。
　　(4)用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG模擬干旱脅迫萌動(dòng)苦豆子種子和幼苗，結(jié)果顯示:干旱脅迫下，子葉中MA和OMA的含量和賴氨酸脫羧酶基因表達(dá)量下降，但重度脅迫（PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞20％）卻使子葉中賴氨酸脫羧酶基因表達(dá)量上升，且超過對(duì)照。葉片中賴氨酸脫羧酶基因表達(dá)量和OMA含量隨PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)和脅迫時(shí)間的變化呈動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，重度脅迫下，賴氨酸脫羧酶基因的表達(dá)和OMA的積累均被抑制;輕度和中度干旱