紅曲霉丙酮酸脫羧酶基因克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析.pdf

1、目的：丙酮酸脫羧酶(Pyruvate decarboxylase, PDC, E.C.4.1.1.1)是丙酮酸代謝的關(guān)鍵酶，它也能催化芳香族氨基酸前體生物轉(zhuǎn)化成光活性α-羥基酮。本研究構(gòu)建紅曲霉cDNA文庫(kù)，篩選得到丙酮酸脫羧酶PDC基因，原核表達(dá)pdc基因，分析并比較紅曲霉重組丙酮酸脫羧酶與野生型丙酮酸脫羧酶的活性與動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的差別。
　　 方法：使用Trizol提取紅曲霉的總RNA，利用Creator SMART cDNA文

2、庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建紅曲霉cDNA文庫(kù)，篩選丙酮酸脫羧酶基因，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)從克隆載體DNA中擴(kuò)增出pdc基因。對(duì)擴(kuò)增片段和表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于氨芐青霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取若干單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性克隆產(chǎn)物送去測(cè)序。將重組質(zhì)粒pET-PDC轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于氨芐青霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取若干單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)陽(yáng)性

3、轉(zhuǎn)化菌，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白，通過Ni2+-NTA agarose親和層析純化后進(jìn)行稀釋復(fù)性。
　　 將紅曲霉在馬鈴薯培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)7天，收集菌體，超聲波破碎細(xì)胞，離心，取上清。硫酸銨（NH4）2SO4鹽析獲得粗酶液，分別經(jīng)凝膠層析柱SephadexG-25與DEAE陰離子交換柱純化蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)純度。
　　 分別測(cè)重組PDC和野生型PDC的活性，并分別分析二者的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，比較兩者的異同點(diǎn)。

4、r>　　 結(jié)果：成功構(gòu)建紅曲酶cDNA文庫(kù)，篩選得到了紅曲霉丙酮酸脫羧酶pdc基因，pdc基因的開放閱讀框長(zhǎng)1713 bp，編碼一個(gè)570個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其序列已向GenBank提交并被收錄，序列號(hào)為HM 191265。重組PDC在原核細(xì)胞E.coli BL21(DE3)中高效表達(dá)，約占菌體總蛋白的32.7％，經(jīng)親和層析純化，重組蛋白的純度達(dá)95％左右。偶聯(lián)酶法測(cè)定該酶的活性，二者的最適反應(yīng)條件均為pH 6.0，30℃，在最適條