大花紅景天酪氧酸脫羧酶基因的克隆與功能分析.pdf

1、紅景天苷是從紅景天(Rhodiola rosea L.)中提取的一種糖苷(又稱配糖體或甙)，是由尿苷二磷酸葡萄糖的半縮醛羥基與另一非糖物質酪醇中的羥基以縮醛鍵(甙鍵)脫水縮合而成的環(huán)狀縮醛衍生物。水解后能生成糖與非糖化合物，非糖部分稱為甙元(Aglycone)，酪醇屬于酚類化合物。紅景天苷具有抗衰老、增強免疫力、保護心血管、抗疲勞、抗輻射、抗腫瘤等作用。但天然藥源植物紅景天中紅景天苷含量較低(0.5％～4.1％，DW)，大大限制了商業(yè)化

2、的生產，紅景天苷的產量遠遠不能滿足市場的需求?；瘜W合成紅景天苷成本高、回收率低，且國內外報道的化學合成紅景天苷的方法相對來說沒有從天然紅景天植物中提取的多。近年來，隨著紅景天生物合成途徑相關酶基因的克隆，基因工程方法成為提高紅景天苷含量的有效途徑之一。本研究在前人研究的基礎上，采用RACE技術，以西藏大花紅景天為研究材料，克隆獲得了紅景天苷生物合成途徑中的關鍵酶酪氨酸脫羧酶基因(TYDC)，并對其做了相應的生物信息學分析和功能驗證。

3、r>　　 TYDC催化酪氨酸轉化生成酪胺(對羥基苯乙胺)，是紅景天苷生物合成途徑中必需的一個酶。本研究基于RACE技術的同源性克隆方法，獲得了RcTYDC基因全長cDNA，為1657bp，RcTYDC編碼區(qū)長為1473 bp，編碼長490個氨基酸的蛋白質，還包含一段長為79 bp的5’-UTR和105bp的3’-UTR，polyA長度為13bp，預測分子量大小為54.6kDa，預測等電點為5.55。
　　 對RcIYDC編碼的

4、氨基酸序列進行生物信息學分析，結果表明RcTYDC與來源于其他植物的TYDC同源性高達45％～51％，且具有典型的TYDC催化活性域。在分子發(fā)育進化樹上，RcTYDC與來源于植物、藻類、細菌、古細菌的TYDCs在發(fā)育進化樹上聚為4支，RcTYDC與來源于植物玉米、水稻的TYDC親緣關系較接近，同屬于植物這一分支?？缒^(qū)分析表明，RcTYDC整個氨基酸序列均不存在跨膜區(qū)，說明其是一個胞質蛋白。對RcTYDC的三級結構模型預測表明，RcTY

5、DC與來源于野豬的TYDC的晶體模型具有高度的相似性，且具有典型的TYDC催化活性位點。對RcTYDC基因進行功能驗證，結果表明將攜帶RcTYDC編碼區(qū)的質粒pET28-RcTYDC轉入大腸桿菌Rosetta進行原核表達之后，能使Rosetta菌株合成大小約53 kDa的重組RcTYDC蛋白。利用尿素對該蛋白進行提取并透析復性后，以L-酪氨酸為反應底物，在輔酶磷酸吡哆醛的存在下，檢測RcTYDC重組蛋白的催化活性，并用HPLC檢測到反應

6、產物酪胺的生成表明本研究中克隆獲得的重組的RcTYDC蛋白具有TYDC酶的活性和功能。
　　 本研究還成功建立了大花紅景天的無菌苗培養(yǎng)體系，構建了RcTYDC基因的植物高效表達載體。本研究的相關工作為紅景天苷生物合成的代謝調控奠定了基礎，為今后在中草藥中開展代謝途徑工程提供了啟發(fā)意義和借鑒價值。隨著紅景天苷生物合成相關酶基因的陸續(xù)被克隆，以及紅景天苷生物合成途徑的進一步認識，利用代謝工程手段提高紅景天苷含量越來越成為可能實施的一