盾殼霉草酸脫羧酶基因的克隆、功能驗證及生防作用研究.pdf

1、核盤菌[Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary]引起的菌核病是一種世界性分布的病害。這種真菌產(chǎn)生的草酸(oxalicacid,OA)在其致病過程中起著決定因子的作用。盾殼霉（Coniothyriumminitans）是核盤菌的一種重寄生真菌和生防菌。前期研究表明:OA對盾殼霉菌絲生長和分生孢子萌發(fā)具有抑制作用;另一方面盾殼霉具有降解OA的能力，從而解除OA對其的毒害。在盾殼霉菌絲提取物中檢測到草酸脫羧酶（

2、Oxalatedeearboxylase，OXDC）活性，暗示OXDC可能參與盾殼霉降解OA。但對于盾殼霉OXDC基因及其表達模式，對于OXDC基因在盾殼霉重寄生作用和抗生作用中的重要性等問題缺乏了解。針對這些問題，本研究采用同源擴增、RACE技術(shù)和反向PCR技術(shù)從盾殼霉基因組中克隆OXDC基因，采用基因敲除和互補技術(shù)對所獲得的兩個OXDC基因（Cmoxdc1和Cmoxdc2）進行功能分析，最后對Cmoxdc1和Cmoxdc2在盾殼霉重

3、寄生及產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)(Antifungalsubstances，AFS)中的作用進行了分析。取得的以下研究結(jié)果:
　　首先，從盾殼霉野生菌株Chy-1中克隆得到兩個草酸脫羧酶基因，分別命名為Cmoxdc1(GenBank登錄號:JF718548)和Cmoxdc2（GenBank登錄號:JF718549）以及它們的啟動子序列。Cmoxdc1全長1587bp，包含3個內(nèi)含子和4個外顯子。外顯子編碼477個氨基酸。Cmoxdc2全長14

4、96bp，包含5個內(nèi)含子和6個外顯子，外顯子編碼408個氨基酸。通過Southern雜交分析，Cmoxdc1和Cmoxdc2在盾殼霉基因組中均為單拷貝基因。通過對Cmoxdc1和Cmoxdc2編碼的蛋白質(zhì)CMOXDC1和CMOXDC2氨基酸序列進行分析，表明CMOXDC1和CMOXDC2序列中均含有真菌OXDC保守的bicupin結(jié)構(gòu)域和Mn2+活性結(jié)合位點。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示:CMOXDC1和CMOXDC2位于兩個不同的分支，但均與

5、小麥穎枯病菌（Phaeosphaerianodorum）的兩個OXDCs親緣關(guān)系最近。
　　第二，明確了OA和pH值對Cmoxdc1和Cmoxdc2表達的影響。Cmoxdc1的表達量隨著OA濃度(2～24mM)的升高(pH值下降)而升高;在pH值范圍為3～8時，Cmoxdc1的表達量在pH值為3時最高，隨pH升高而降低，在pH8條件下Cmoxdc1的表達量最低，僅為pH3表達量的0.05％。說明Cmoxdc1受低pH誘導(dǎo)。Cmox

6、dc2表達不受OA濃度(2～24mM)的影響，在pH值范圍為3～8時，Cmoxdc2在pH值為5時表達量最高。
　　第三，分別獲得了Cmoxdc1的敲除突變體△Cmoxdc1-195和△Cmoxdc1-198，以及Cmoxdc2的敲除突變體△Cmoxdc2-23，并對這些敲除突變體中的缺陷基因分別進行了互補，分別得到了互補轉(zhuǎn)化子△Cmoxdc1-195C、△Cmoxdc1-198C和△Cmoxdc2-23C。各突變體在PDA平板上

7、均能正常生長及產(chǎn)孢(20℃)。生長速率和產(chǎn)孢量與野生型菌株差異不大。但在含有4mM和8mMOA的PDA平板上（含0.01％溴酚藍），突變體△Cmoxdc1-195和△Cmoxdc1-198生長緩慢，培養(yǎng)基沒有變成藍色，暗示pH值低，而突變體△Cmoxdc1-198、△Cmoxdc1-195C、△Cmoxdc2-23和△Cmoxdc2-23C生長速率則與野生型菌株沒有明顯差異，培養(yǎng)基由黃色變成藍色，暗示pH值高。在含有16mMOA的PDA

8、平板上，各突變體及野生型菌株均不能生長?？梢?，敲除Cmoxdc1導(dǎo)致盾殼霉耐受OA的能力下降，而敲除Cmoxdc2對盾殼霉耐受OA沒有影響。在含OA(8mM和16mM)的PDB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)(20℃，150rpm，12d)時，突變體△Cmoxdc1-195和△Cmoxdc1-198的生物量、培養(yǎng)基pH和殘存OA量與野生型菌株顯著差異（P＜0.05）。突變體△Cmoxdc1-195和△Cmoxdc1-198的生物量與野生型相比下降了20

9、～37％，培養(yǎng)液最終pH值為3.5～4.4，OA降解率僅為60％。而互補轉(zhuǎn)化子△Cmoxdc1-195C和△Cmoxdc1-198C及野生型對OA的降解率達到90％以上。突變體△Cmoxdc2-23和互補轉(zhuǎn)化子△Cmoxdc2-23C在含OA的PDB培養(yǎng)液中菌絲生物量、培養(yǎng)液最終pH值及OA降解率與野生型均沒有顯著差異(P＞0.05)。可見，Cmoxdc1在盾殼霉降解OA中起部分作用，而Cmoxdc2在盾殼霉降解OA中不起作用。

10、　　第四，明確了Cmoxdc1和Cmoxdc2對盾殼霉重寄生作用的影響及其機制。在重寄生作用方面，Cmoxdc1敲除突變體對正常分泌OA的核盤菌菌株A5菌落的侵染能力明顯低于其互補轉(zhuǎn)化子及野生型，而對草酸分泌缺陷的核盤菌菌株P(guān)B菌落的侵染能力與其互補轉(zhuǎn)化子及野生型菌株沒有差別。Cmoxdc2敲除突變體對菌株A5和PB菌落的寄生能力與其互補轉(zhuǎn)化子及野生型菌株沒有差異?？梢?，Cmoxdc1在盾殼霉寄生核盤菌菌絲中起著重要作用，而Cmoxdc

11、2對盾殼霉寄生核盤菌菌絲沒有影響。對核盤菌菌核寄生的結(jié)果表明:Cmoxdc1敲除突變體、Cmoxdc2敲除突變體及其互補轉(zhuǎn)化子均能寄生核盤菌菌核。其寄生致腐指數(shù)與野生菌株沒有顯著差異(P＞0.05)。原因在于菌核組織中OA濃度極低（0.08mgOA/g菌核，約為0.01mM）。
　　為了明確Cmoxdc1在盾殼霉寄生核盤菌菌絲中的作用，研究了在OA存在及OA不存在的情況下各盾殼霉突變體及野生型菌株幾丁質(zhì)酶基因（Cmch1）和β-1

12、，3-葡聚糖酶基因（Cmg1）的表達，以及胞外蛋白酶的產(chǎn)生。結(jié)果表明:在OA存在的情況下，Cmoxdc1敲除突變體的Cmch1和Cmg1基因表達，以及胞外蛋白酶的產(chǎn)生受到明顯抑制。
　　第五，明確了Cmoxdc1與盾殼霉產(chǎn)生AFS的關(guān)系。通過比較Cmoxdc1敲除突變體、Cmoxdc2敲除突變體、互補轉(zhuǎn)化子及野生型在含有OA的PDB培養(yǎng)基中產(chǎn)生AFS的能力，結(jié)果表明:Cmoxdc1敲除突變體不能完全降解OA，培養(yǎng)物pH值始終維持在

13、酸性水平，培養(yǎng)物濾液抑制核盤菌生長并抑制核盤菌侵染油菜葉片組織的效果顯著(P＜0.05)高于其它突變體及野生型。由此推知:Cmoxdc1敲除突變體產(chǎn)生AFS的能力顯著提高。
　　根據(jù)上述結(jié)果，可以看出Cmoxdc1在盾殼霉與核盤菌互作中扮演著重要角色。一方面盾殼霉利用OA營造的酸性環(huán)境產(chǎn)生AFS，并表達Cmoxdc1，導(dǎo)致OA被降解。另一方面，隨著OA被分解，導(dǎo)致環(huán)境pH值升高，促使盾殼霉表達重寄生相關(guān)基因（Cmch1、Cmg1和