彩絨革蓋菌草酸脫羧酶的誘導(dǎo)制備.pdf

1、草酸脫羧酶是一種含錳的酶，在木腐菌中廣泛存在，少數(shù)低等真菌和細(xì)菌中也能產(chǎn)生。該酶的應(yīng)用主要集中在以下幾方面：造紙廢水中的草酸鹽降解；食品中的草酸降解；草酸的生物法檢測(cè)(如臨床診斷、食品中草酸檢測(cè))等。由于草酸脫羧酶產(chǎn)量較低和提取較困難，使得草酸脫羧酶的生產(chǎn)成本大大提高，從而限制了該酶的應(yīng)用。一些特殊氨基酸序列的存在決定了該酶的表達(dá)形式為誘導(dǎo)型，菌株的基因調(diào)控序列中含有一段受草酸化合物作用的序列，并有一段可以被低pH誘導(dǎo)的序列，具體的誘導(dǎo)

2、調(diào)控機(jī)制不詳。為了進(jìn)一步了解該酶的詳細(xì)誘導(dǎo)機(jī)制，進(jìn)而提高其產(chǎn)量，本研究利用各種酸誘導(dǎo)彩絨革蓋菌制備草酸脫羧酶，并初步推測(cè)了各種酸誘導(dǎo)產(chǎn)酶的機(jī)制(底物誘導(dǎo)和低pH值誘導(dǎo))，并嘗試優(yōu)化了該酶的提取條件。 本課題首先研究彩絨革蓋菌的誘導(dǎo)產(chǎn)酶。主要研究該酶的各項(xiàng)誘導(dǎo)因素，包括誘導(dǎo)劑的種類(lèi)、誘導(dǎo)pH值等影響因素。所用的誘導(dǎo)劑為無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸及有機(jī)酸根離子(例如鹽酸、硫酸、磷酸、草酸、醋酸、檸檬酸、草酸根離子、醋酸根離子、檸檬酸根離子等)，

3、控制其離子強(qiáng)度和培養(yǎng)液pH值來(lái)觀察誘導(dǎo)產(chǎn)酶情況。 通過(guò)測(cè)定菌體生長(zhǎng)過(guò)程中的不同參數(shù)(例如酶活、蛋白含量、生物量等)來(lái)比較不同誘導(dǎo)條件下的產(chǎn)酶優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)酸可以顯著誘導(dǎo)彩絨革蓋菌合成草酸脫羧酶，其中硫酸的誘導(dǎo)效果最好，比酶活Ⅰ最高為10.0U/g菌體干重；比酶活Ⅱ最高為3.2U/mg蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)還研究了pH值對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響，發(fā)現(xiàn)pH2.5較利于誘導(dǎo)草酸脫羧酶。有機(jī)酸中草酸的誘導(dǎo)效果最好，添加草酸后第二天獲得最大酶活，比酶活Ⅰ

4、最高為6.7U/g菌體干重，比酶活Ⅱ最高為1.0U/mg蛋白質(zhì)，其后酶活逐漸消失。檸檬酸的酶活在培養(yǎng)后期逐漸升高。有機(jī)酸根離子中醋酸鈉的誘導(dǎo)效果最好，比酶活Ⅰ最高達(dá)1.8U/g菌體干重，比酶活Ⅱ最高達(dá)0.2U/mg蛋白質(zhì)。 對(duì)各種誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)產(chǎn)酶結(jié)果進(jìn)行綜合比較，發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)酸的誘導(dǎo)效果最好，體積酶活較高，都大于20.0U/L，酶產(chǎn)率都大于2.5U/(L·d)，最大比酶活Ⅱ都大于9.5U/g菌體干重。根據(jù)各種誘導(dǎo)劑在發(fā)酵液中存在的形