盾殼霉產(chǎn)孢相關(guān)基因的克隆及液體產(chǎn)孢條件的優(yōu)化.pdf

1、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)是重要的植物病原真菌,給油菜、向日葵等作物的生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失。盾殼霉(Coniothyrium minitans)是核盤菌的重寄生真菌,是作物菌核病的重要生防菌。本文對T-DNA標記插入突變產(chǎn)孢缺陷型菌株ZS-1T16229中相關(guān)基因進行了部分克隆及序列分析,并對ZS-1菌株在液體振蕩培養(yǎng)下促進產(chǎn)孢的條件進行了探討,結(jié)果如下:
　　 從盾殼霉ZS-1菌株T-DNA

2、標記插入突變體庫中篩選出的菌絲生長、產(chǎn)孢缺陷型突變株ZS-1T16229,以之為材料,采用TAIL-PCR技術(shù)對T-DNA標記插入位點右側(cè)的基因組DNA2進行了克隆,獲得了大小為1131bp的DNA片段；對該基因組DNA片段進行了序列分析,并利用GenScan軟件進行了閱讀框(ORF)預(yù)測,結(jié)果表明該DNA片段中可能含有一個不完整的閱讀框(324-1100nt),編碼259aa。對推定蛋白的氨基酸序列進行了同源性比較(Blastp),發(fā)

3、現(xiàn)該蛋白含有保守的Pex2-Pex12結(jié)構(gòu)域,與真菌的過氧化物酶體蛋白PEX2有極高的同源性,如與煙曲霉(Aspergillus fumigatus Af293)的PEX2相同部位等同的氨基酸為59％,類似的氨基酸達74％。命名該基因為CMPEX2,證實T-DNA標記在ZS-1T16229中為單拷貝插入,破壞CMPEX2的后半部分。PEX2參與真菌的活性氧代謝,消解活性氧的毒害作用。研究發(fā)現(xiàn),與出發(fā)菌株相比,突變體ZS-1T16229偏

4、向于培養(yǎng)基質(zhì)中生長,推定與緩解活性氧對菌體毒害作用有關(guān),CMPEX2基因可能與ZS-1T16229的產(chǎn)孢缺陷型等表型相關(guān)。
　　 探討了在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)中添加少量瓊脂粉(0.1‰-1.5‰w/v)對盾殼霉ZS-1菌株的生物產(chǎn)量及產(chǎn)孢的促進作用。研究發(fā)現(xiàn),在PDB添加不同量的瓊脂粉對ZS-1菌株的生物產(chǎn)量和產(chǎn)孢均有顯著的促進作用。命名該液體培養(yǎng)基為PDB-1a,其中當瓊脂粉的添加量為0.75‰時,綜合效果最為理想

5、,在此條件下,于100 ml PDB中培養(yǎng)10d ZS-1菌株的生物產(chǎn)量達616.1±6.2mg,孢子產(chǎn)量為(6.1±0.1)×109個/100 ml PDB-1a,與對照(PDB)相比,生物產(chǎn)量提高了40.4％,孢子產(chǎn)量提高了260.9％。
　　 以含0.75‰瓊脂粉的PDB-1a為培養(yǎng)液,研究了ZS-1菌株生長和產(chǎn)孢時間動態(tài)、接種量和裝液量對產(chǎn)孢的影響,并以瓊脂粉的添加量、接種量和培養(yǎng)時間為影響因子,進行了正交實驗并對結(jié)果進

6、行了分析。發(fā)現(xiàn)ZS-1菌株生長速度加快,生物產(chǎn)量及產(chǎn)孢于第8d達到高峰,而對照中于第11d生物產(chǎn)量和產(chǎn)孢的高峰期,縮短3d；裝液量對生長和產(chǎn)孢均有顯著影響,其中于250 ml三角瓶中添加100 mlPDB-1a,菌株的生物產(chǎn)量達614.5±9.3mg,產(chǎn)孢達(6.2±0.2)×109個/100 mlPDB-1a。接種量對菌株的生物產(chǎn)量和產(chǎn)孢有顯著的影響,其中最佳接種量是6 ml孢子懸液/100 ml PDB-1a(孢子懸液的濃度為107

7、孢子/ml PDB),此時,生物產(chǎn)量為619.1±10.8g,產(chǎn)孢量為(6.2±0.1)×109個/100 ml PDB-1a。正交分析發(fā)現(xiàn),在含0.75‰瓊脂粉的PDB-1a為培養(yǎng)液、接種量為6 ml孢子懸液/100 mlPDB-1a(孢子懸液的濃度為107孢子/ml PDB)、培養(yǎng)時間為8d的綜合條件下液體振蕩培養(yǎng),菌株生長和產(chǎn)孢最好。
　　 研究發(fā)現(xiàn)0.75‰PDB-1a對盾殼霉其它2個能在液體振蕩培養(yǎng)條件下產(chǎn)孢的菌株(C

8、M37和CM38)的生物產(chǎn)量和產(chǎn)孢都有顯著的促進作用；對在液體振蕩培養(yǎng)條件下不產(chǎn)孢的菌株Chy-1可以明顯促進其生物產(chǎn)量的提高,但不能促使其產(chǎn)孢,表明PDB中添加少量的瓊脂粉從本質(zhì)上不能誘導(dǎo)盾殼霉產(chǎn)孢。研究還發(fā)現(xiàn)PDB-1a對草酸青霉(Penicillium oxalicum)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、木霉(Trichoderma spp)和禾谷鐮孢菌(Fusarium.graminearum)等4種絲孢綱真菌