24109.綠僵菌微循環(huán)產(chǎn)孢相關(guān)基因maaga、pyk、pp5的克隆和功能分析

1、綠僵菌微循環(huán)產(chǎn)孢相關(guān)基因MaAGA、Pyk、PP5的克隆和功能分析重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文學(xué)生姓名：徐飛指導(dǎo)教師：夏玉先教授專業(yè)：生物學(xué)學(xué)科門類：理學(xué)重慶大學(xué)生物工程學(xué)院二O一一年四月重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要I摘要綠僵菌（Metarhiziumanisopliae）是一種重要的昆蟲病原真菌，它能侵染50多個科中的200多種昆蟲：如蝗蟲、白蟻、螞蚱、牧草蟲等，是目前廣泛應(yīng)用的微生物農(nóng)藥來源之一，關(guān)于其侵染與致病機制目前已經(jīng)得到廣泛的研究和

2、了解。孢子是其生物防治中的毒力單位，在疾病循環(huán)的繁殖和致病性上起著重要的作用。在模式生物粗糙脈胞菌、構(gòu)巢曲霉等絲狀真菌中，兩種主要的產(chǎn)孢模式已經(jīng)被闡述：正常產(chǎn)孢和微循環(huán)產(chǎn)孢。綠僵菌作為一種絲狀病原真菌，也具有這兩種典型的產(chǎn)孢模式。與正常產(chǎn)孢相比，綠僵菌的微循環(huán)產(chǎn)孢具有繁殖快速、抗逆性強等諸多優(yōu)勢。因此，較好的理解微循環(huán)產(chǎn)孢的分子機制，將會極大的提高綠僵菌的商業(yè)化生產(chǎn)，擴大昆蟲防治中的病原真菌應(yīng)用范圍。但是，以前的微循環(huán)產(chǎn)孢研究主要集中于

3、誘導(dǎo)條件的探索，關(guān)于其詳細分子機制研究較少。基于本實驗室先前構(gòu)建了綠僵菌微循環(huán)產(chǎn)孢時期的差減文庫，獲得了221條特異的EST（表達序列標簽）基因序列，本研究選取了其中的3個高表達基因：MaAGA，Pyk，PP5，克隆了這3個重要基因并進一步進行了相關(guān)的分子水平研究，其主要研究內(nèi)容為：（一）MaAGA調(diào)控綠僵菌的微循環(huán)產(chǎn)孢過程及耐熱性1克隆了MaAGA基因的cDNA（Genebank登錄號：HM068369），并進行了生物信息分析。MaA

4、GA基因cDNA片段含有2個內(nèi)含子，開放閱讀框為978bp，編碼325個氨基酸，預(yù)測編碼蛋白大小為35.05KDa，等電點為5.1。與粗糙脈胞菌中的精氨酸酶基因具有72%的同源性，EValue值為6e12。并且，在Genebank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，顯示綠僵菌中該基因具有精氨酸酶蛋白典型的二價錳離子結(jié)合位點、精氨酸結(jié)合及催化位點等。同時，進一步的進化樹分析顯示，該基因具有非常強的保守性，與植物具有21%23%的相似性，與細菌具有3

5、0%38%的相似性，與真菌和動物分別有40%以上的相似性2通過RNAi手段干擾該基因的表達。設(shè)計該基因的最佳干擾區(qū)域，連接至高效的RNA干擾載體中，基因槍轉(zhuǎn)化野生型綠僵菌，通過篩選培養(yǎng)基及PCR雙重驗證，篩選獲得5個穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化菌株。進一步，通過定量PCR和酶學(xué)水平檢測該基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的受干擾程度，其干擾效率均在22%62%之間。3MaAGA基因的對產(chǎn)孢模式的影響。對干擾效率最高的轉(zhuǎn)化菌株進行后續(xù)功能研究，在微循環(huán)產(chǎn)孢培養(yǎng)基上發(fā)