23059.綠僵菌磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因的克隆及功能分析

1、綠僵菌磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因的克隆及功能分析重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文學(xué)生姓名：李敏指導(dǎo)教師：曹月青副教授專業(yè)：生物學(xué)學(xué)科門類：理學(xué)重慶大學(xué)生物工程學(xué)院二O一一年四月重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要I摘要昆蟲病原真菌綠僵菌（Metarhiziumacridum）是一類重要的生防微生物。國(guó)內(nèi)外對(duì)其致病機(jī)理進(jìn)行了大量的研究，主要集中在侵染期、侵入期和產(chǎn)孢期。其中侵入期即綠僵菌侵入寄主血腔，定殖、適應(yīng)血淋巴這個(gè)階段的研究對(duì)于真菌致病性的研究具有重要意義。

2、我們課題組構(gòu)建了綠僵菌侵入蝗蟲體內(nèi)階段cDNA差減文庫，在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過分析比對(duì)，我們選擇了長(zhǎng)度分別為320bp的EST片段。這個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)同其他真菌中的磷酸甘露糖異構(gòu)酶有很高的同源性，通過cDNA文庫篩選，獲取其編碼框；通過基因組步移法獲得其DNA全長(zhǎng)。利用RNAi的方法研究了磷酸甘露糖異構(gòu)酶（Mapmi）的功能。主要研究結(jié)果如下：①獲取了Mapmi基因的F和DNA全長(zhǎng)，并進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析。Mapmi基因的F為1326

3、bp，其Genbank登錄號(hào)為HQ123439。預(yù)測(cè)該基因編碼441個(gè)氨基酸。利用其F與綠僵菌基因組數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，獲得該基因的基因組DNA全長(zhǎng)為1386bp。利用DNAMAN軟件對(duì)DNA序列和F序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)60bp的內(nèi)含子，內(nèi)含子位于距離起始密碼145bp處，具有典型的GT….AG邊界。通過網(wǎng)上軟件預(yù)測(cè)該基因的分子量為47.65kDa，等電點(diǎn)為5.31，利用SignalP分析發(fā)現(xiàn)無信號(hào)肽。②采用RNAi

4、的方法抑制其轉(zhuǎn)錄水平來初步確定Mapmi基因可能具有的功能。構(gòu)建RNAi干擾載體pK2RNAiMapmi，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化綠僵菌CQMa102，并用PCR方法驗(yàn)證提取的綠僵菌基因組，選取10個(gè)Mapmi基因的轉(zhuǎn)化子，并通過定量PCR測(cè)定Mapmi基因在干擾突變株和野生菌株中的表達(dá)差異。測(cè)定結(jié)果分析，干擾突變株Mapmi基因表達(dá)被抑制后，干擾效率在42.5%89.8%之間。③我們觀察了Mapmi基因突變菌株在含有各類不同的細(xì)胞

5、脅迫劑的PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)及其形態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾菌株在含有CR、KCl和H2O2的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)明顯受到抑制；在加了KCl的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)受抑制程度最大。在不加任何東西的固體PDA培養(yǎng)基上，干擾型生長(zhǎng)速度和野生型相差不顯著。野生型在各類培養(yǎng)基上生長(zhǎng)正常。④分析了Mapmi基因干擾菌株在不同碳源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。干擾菌株和野生菌株的孢懸液分別接種于以葡萄糖或果糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果表明，與野生型相比，干擾株的生長(zhǎng)明顯受到