綠僵菌微循環(huán)產(chǎn)孢及相關(guān)基因分析.pdf

1、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)是一類應(yīng)用廣泛的昆蟲(chóng)病原真菌，在昆蟲(chóng)防治中起著重要作用。病原真菌主要以孢子侵染昆蟲(chóng)，菌株的產(chǎn)孢能力是菌株選育時(shí)的重要參數(shù)。迄今為止，對(duì)于殺蟲(chóng)真菌農(nóng)藥生產(chǎn)直接相關(guān)的產(chǎn)孢機(jī)制的研究只有很少的報(bào)道。 包括綠僵菌在內(nèi)的大多數(shù)的絲狀真菌是在由菌絲分化出來(lái)的分生孢子梗上形成分生孢子即正常產(chǎn)孢。本研究發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌(M.anisopliae)CQMa102在SYA固體培養(yǎng)基上可以進(jìn)

2、行微循環(huán)產(chǎn)孢——孢子萌發(fā)后不經(jīng)過(guò)菌絲階段直接產(chǎn)孢。這種微循環(huán)產(chǎn)孢的特點(diǎn)是接種后孢子在培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量似酵母狀粘性孢子。 為了研究微循環(huán)產(chǎn)孢的分子機(jī)制，本研究以金龜子綠僵菌(M. anisopliae)菌株CQMa102為研究材料對(duì)微循環(huán)產(chǎn)孢進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究。首先對(duì)綠僵菌CQMa102的微循環(huán)產(chǎn)孢培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，確定了一種適合金龜子綠僵菌CQMa102微循環(huán)產(chǎn)孢的培養(yǎng)基。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了綠僵菌微循環(huán)產(chǎn)孢時(shí)期的均一化全長(zhǎng)cDN

3、A文庫(kù)和富集微循環(huán)產(chǎn)孢相關(guān)基因的差減文庫(kù)，并對(duì)差減文庫(kù)進(jìn)行了篩選。最后用生物信息學(xué)的方法對(duì)得到的ESTs(Expression Sequence Tag)進(jìn)行了分析。 主要研究結(jié)果如下： ①利用數(shù)碼生物顯微鏡觀察CQMa102在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢過(guò)程。在SYA培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)了微循環(huán)產(chǎn)孢現(xiàn)象。 ②對(duì)綠僵菌的這兩種不同的產(chǎn)孢方式進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在產(chǎn)孢總量還是產(chǎn)孢速度方面微循環(huán)產(chǎn)孢都優(yōu)于正常產(chǎn)孢。 ③采用DS

4、N(duplex-specific nuclease)均一化技術(shù)與SMARTm<'TM>(switchingmechanism at 5'end ofRNAtranscript)建庫(kù)技術(shù)相結(jié)合的方法，成功構(gòu)建了綠僵菌菌株CQMa102微循環(huán)產(chǎn)孢時(shí)期的均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。 ④以微循環(huán)產(chǎn)孢時(shí)期的綠僵菌為實(shí)驗(yàn)方(tester)以正常產(chǎn)孢時(shí)期的綠僵菌菌絲為驅(qū)動(dòng)方(driver)，利用抑制消減雜交(suppression subtra

5、ctive hybridization，SSH)的方法構(gòu)建了綠僵菌CQMa102微循環(huán)產(chǎn)孢時(shí)期的差減文庫(kù)。 ⑤對(duì)差減文庫(kù)中的1600個(gè)克隆進(jìn)行了斑點(diǎn)雜交篩選和Reverse Northern dotblot篩選，得到400個(gè)陽(yáng)性克隆，測(cè)序后得到340條質(zhì)量較好的ESTs，代表285條非冗余ESTs。 ⑥在GenBank上用BLASTx對(duì)其進(jìn)行序列同源性比對(duì)。結(jié)果表明109條ESTs編碼產(chǎn)物與己知蛋白質(zhì)序列同源性較低或找不