金龜子綠僵菌耐夏季高溫能力的種內變異、一新孢壁蛋白的基因克隆及功能鑒定.pdf

1、作為真菌殺蟲劑的有效成份，金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)的氣生分生孢子很容易在諸如稻米、大麥等谷物固體基質上大量生產，并配制成適當劑型用于害蟲防治。分生孢子對環(huán)境脅迫的耐受力決定了其制劑的貯存穩(wěn)定性和田間持效性，而夏季高溫就是最重要的脅迫因子之一。建立定量合理、結果可靠、簡便易行的定量評價體系，是篩選耐夏季高溫生產菌株的重要基礎。另一方面，孢壁是由多種蛋白質、幾丁質和多糖類物質組成的孢子保護結構，尤其眾多孢

2、壁蛋白的功能，目前可知者寥寥。為此，作者研究建立了生防真菌耐夏季高溫能力的定量評價體系，并應用于不同寄主和地理來源的18株綠僵菌分生孢子的耐熱力比較測定；在此基礎上對18株金龜子綠僵菌的甲酸可抽提的孢壁蛋白進行了比較分析，從中發(fā)現(xiàn)了一條9.9 kDa的全新孢壁蛋白，并成功地進行了基因克隆和功能鑒定。主要研究內容和結果分述如下：
　　 金龜子綠僵菌耐夏季高溫能力的種內變異對不同寄主和地理來源的18株綠僵菌，包括8株變種未知的金龜子

3、綠僵菌(M. anisopliae；用Ma表示)、4株金龜子變種(M。anisopliae var. anisopliae； Maan)和6株蝗變種(M. anisopliae var. acridum； Maac).進行了48℃熱脅迫實驗和10-35℃下的菌落生長數(shù)率的測定。首先，用稻米基質上生產的孢子粉配制成孢子懸液，于玻璃試管中在48℃下水浴脅迫，每隔15 min從試管中取樣涂板，培養(yǎng)24 h并測定殘存活孢率，直至活孢率等于或接近

4、于零為止。用供試菌株相對于對照的殘存指數(shù)擬合衰變模型(0.975≤r2≤0.999)，再用擬合的模型參數(shù)計算各菌株的半致死時間(LTso)，作為其耐受48℃熱脅迫能力的定量指標。所獲LTso在供試菌株中差異很大，源于非洲蝗蟲7株菌的LTso平均高達110(73-150) min，但在10和15℃下不能形成平板菌落；源于其他寄主的5個菌株在10-35℃下都能生長良好，但平均LT50僅16(10-26)min。根據(jù)供試菌株的LT50，選出對

5、48℃熱脅迫耐受能力強、中、弱的三個典型菌株，分別對其進行38、40、42和45℃下的耐熱力測定，其中38℃下的測定時間長達4天。結果顯示，隨著脅迫溫度的升高，LT50呈下降趨勢。耐熱力強、中、弱三株菌的LT50從38℃下的8256、1612和507 min分別降至48℃下的167、53和20 min。三株典型菌株的LT50與供試5個脅迫溫度均存在顯著的逆相關(0.881≤r2≤0.980)。由此，準確高效篩選用于害蟲防治的耐夏季高溫的

6、優(yōu)良菌株，最佳脅迫溫度是45-48℃，脅迫實驗的時間在6h以內。
　　 金龜子綠僵菌孢壁蛋白抽提與組分分析用甲酸法抽提18株供試真菌分生孢子的孢壁蛋白，抽提物中孢壁蛋白的含量在不同菌株間差異極顯著(F17.36=267.0，P<0.01)，最高的菌株Ma2421為50.2±1.2μg/mg孢子，而一株蝗變種菌株Maac6421僅有3.4±0.5μg/mg。種內不同變種間的比較顯示，8株金龜子綠僵菌的平均含量為28.4±12.3μ

7、g/mg，4株金龜子變種的平均含量為27.3±15.1μg/mg，均顯著高于6株蝗變種的平均含量14.7±8.4μg/mg。此外，變種內不同菌株問的孢壁蛋白含量也差異極顯著(Ma: F7，16=212.9，P<0.01；Maac: F5.12=263.2，P<0.01；Maan: F3，8=238.2，P<0.01)。對不同菌株孢壁蛋白的組分進行SDS- PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)多條條帶，分子量9.0-90 kDa不等，菌株間孢壁蛋白組分

8、差異極大；僅蛋白含量最低的Maac6421菌株無可分辯條帶。一條約9.9 kDa的條帶為多個供試菌株共有，命名為CWP10，作為目標蛋白進行深入研究。
　　 一種新孢壁蛋白CWP10的基因克隆與功能鑒定將供試菌株分生孢子甲酸抽提物的SDS-PAGE分析中最顯著的菌株Maan4132蛋白條帶CWP10進行分離純化，通過N端測序和DNA擴增，獲得了該蛋白的全長基因CWP10，總長為535 bp(GenBank accessionnu

9、mber: FJ548848)，其中開放閱讀框(ORF)為363 bp，含有三個大小分別為57、63和52bp的內含子，將編碼區(qū)分隔成四個外顯子。Southem雜交顯示，CWP10在綠僵菌基因組中呈單拷貝。編碼區(qū)翻譯一條由120個氨基酸組成的蛋白肽段，DNAstar分析顯示其分子量為13.3 kDa，等電點為7.49。該基因及其編碼的蛋白在GenBank和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中沒有找到任何同源序列，因而是一全新的基因和蛋白。對照翻

10、譯后的氨基酸序列和蛋白N端測序結果，CWP10應是一種分泌型蛋白，在其N端一條32個氨基酸的信號肽被切除后，成為一個9.9 kDa的成熟蛋白。經疏水性預測分析和糖基化染色檢測，CWP10并無疏水特征，也非糖基化蛋白。其N端信號肽結構包含一個約10個殘基的疏水核心，并以4個極性氨基酸(QYYT)作為C端結尾。用膠體金標記定位CWP10，發(fā)現(xiàn)其大量分布于孢壁內層，而在孢壁外層及細胞質中分布較少。用CWP10的多克隆抗體對18株供試菌進行We

11、stem雜交檢測，結果在7株的分生孢子中檢測到該蛋白的存在。
　　 將來自Maan4132的新孢壁蛋白基因CWP10，通過芽生孢子轉化體系轉入無此孢壁蛋白的球孢白僵菌(Beuaveria bassiana)的野生菌株BbW中，所獲轉化子BbT的分生孢子的疏水性被顯著提高10.5％，對聚苯乙烯疏水介質的附著力提高55.2％。但是，與野生菌株相比，轉化子的分生孢子對48℃熱脅迫和7.0J/cm2的UV.A輻射劑量及0.7 J/cm2