綠僵菌的殺蚜潛力評價與球孢白僵菌、綠僵菌及玫煙色擬青霉的孢子疏水性相關特征的解析及利用.pdf

1、白僵菌、綠僵菌和擬青霉等常見絲孢類昆蟲病原真菌是害蟲微生物防治的重要資源。菌株分生孢子對靶標害蟲的毒力以及孢子疏水特性是孢子制劑研制中要考慮的兩個重要因素。前者決定真菌制劑的生防潛力，后者決定孢子對昆蟲體壁的吸附，并影響孢子的水相分散效果。本研究評價了23株綠僵菌對桃蚜(Myzus Persicae)的生防潛力，篩選出一批高效殺蚜菌株；系統(tǒng)測定了球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、綠僵菌(Metarhizium spp.

2、)和玫煙色擬青霉(Paecilomycesfumosoroseus)的48個菌株的分生孢子疏水性，揭示了孢子大小、孢壁疏水蛋白含量與孢子疏水性之間的關系，提出了在孢子懸乳劑設計中根據孢子疏水性優(yōu)化孢子制劑配方和應用效果的策略。主要內容和結果分述如下：
　　 綠僵菌對桃蚜的毒力測定挑選地理和寄主來源不同的23株綠僵菌株，包括金龜子綠僵菌M anisopliae，金龜子綠僵菌金龜子變種M anisopliae var. anisop

3、liae，金龜子綠僵菌蝗變種M anisopliae var. acridum，金龜子綠僵菌大孢變種M anisopliae var。majus及黃綠綠僵菌小孢種M flavoviride var. minus，對桃蚜Myzus Persicae進行平均為11.5、99和1179個孢子/mm2的低、中、高劑量處理的生物測定，每處理3次重復，每重復為甘藍葉片上的成蚜40～50頭，對照為含0.02％吐溫80。采用標準噴塔法接種，接種后的桃蚜

4、飼養(yǎng)于培養(yǎng)箱(21±1℃，14L:10D)中逐日觀察8天，所獲數據經時間一劑量-死亡率模型模擬分析。結果表明，所有供試菌株對桃蚜都有致病性，高接種劑量下的累計死亡率為0.8～95.3％。其中的10株綠僵菌在高劑量下的死亡率超過50％。根據模型模擬產生的劑量效應和時間效應參數計算出這些菌株對桃蚜的致死中劑量LCso和致死中時LT50，有6株綠僵菌表現理想的殺蚜活性，第5天的LC50為23～189個孢子/mm2，第8天為8～93個孢子/mm

5、2。各菌株對桃蚜的LT50隨接種劑量增加而下降。在200個孢子/mm2的劑量下，6株高毒力菌株的LT50在5天以內；而在600個孢子/mm2的劑量下，各菌株的LT50收斂至4天以內。此外，對供試菌株蚜尸顯癥率的觀察發(fā)現，此6株菌致死的蚜尸有80％以上都產生大量分生孢子，顯示出較佳的流行潛力。這是關于綠僵菌對蚜蟲生防潛力的首次評價。
　　 孢子疏水性與孢子大小的關聯在改良的水/油分層體系中評價了48株綠僵菌、球孢白僵菌和玫煙色擬青

6、霉的疏水率Hi，疏水率變化范圍在59.7～92.2％，不同菌種或同一菌種的不同菌株間均存在顯著差異。平均疏水率在綠僵菌高達83.3％，白僵菌為78.6％，擬青霉為72.5％。所有菌株的單孢表面積也存在極顯著差異，7.9～25.3μm2不等。其中，綠僵菌的平均單孢表面積(Sa)為14.4±3.8μm2，顯著大于球孢白僵菌的10.1±1.1μm2和玫煙色擬青霉的9.0±0.9μm2，而后兩者之間差異不顯著。相關性分析顯示，48株菌的Hi與S

7、a之間顯著正相關(r2=0.55)，說明不同菌株間孢子疏水率變異的55％可歸因于其孢子大小的不同。孢子表面積與孢子密度之間呈顯著的逆相關(r2=0.95)，表明等重的不同菌株孢子粉的含孢量因孢子大小而異，是孢子制劑設計中需要考慮的重要因素。
　　 孢子疏水性與三氟乙酸可溶孢壁蛋白含量的關聯選擇6株孢子大小和疏水率均具代表性的菌株，將其分生孢子分別用煮沸2％ SDS、甲酸(FA)冰浴和三氟乙酸(TFA)冰浴進行分步抽提。抽提物經S

8、DS-PAGE電泳分析顯示，TFA可溶蛋白組份明顯有別于SDS和FA抽提且可溶的孢壁蛋白組份，其蛋白條帶稀少，分子量為10～14 kDa。經掃描電鏡觀察和疏水率檢測發(fā)現，孢壁表面疏水蛋白組成的短棒層的消失，僅發(fā)生在TFA抽提(綠僵菌)或FA抽提(白僵菌和擬青霉)之后，且孢壁短棒層的消失伴隨著孢子疏水性的巨降。由于白僵菌和擬青霉孢子的FA抽提物中沉淀經TFA進一步處理后才溶于2％ SDS，且白僵菌的TFA解離物與其已知疏水蛋白Hydl(1

9、3.81 kDa)和Hyd2(11.98 kDa)的多克隆抗體呈陽性反應，由此推測三種菌的三氟乙酸可溶(TFAS)的孢壁蛋白組份就是孢壁疏水蛋白，而綠僵菌和玫煙色擬青霉的TFAS蛋白是未見報道的孢壁疏水蛋白。
　　 上述TFAS孢壁蛋白的含量在6株菌間差異極顯著，范圍為21.5～91.9μg/mg孢子，剔除孢子大小的影響，換算為2.7～44.8μg/107個孢子，菌株間差異也極顯著。所測菌株的孢子疏水率與剔除孢子大小影響的TFA

10、S蛋白含量顯著正相關(r2=0.79)，顯示孢子疏水率變異的79％歸因于菌株TFAS蛋白即孢子疏水蛋白的含量不同。因此，孢壁疏水蛋白含量是決定孢子疏水率的關鍵因素。
　　 孢子懸乳劑的水相分散率與孢子疏水性的關聯將6株孢子大小和疏水率不同的分生孢子粉懸浮于由2.0～5.5％乳化劑AE0-3和94.5～98.0％液體石蠟組成的乳油中，配成標準濃度為1×1010個孢子的懸乳劑，用水稀釋100倍后，測定不同濃度乳化劑配方中的孢子水相分

11、散力。結果顯示，稀釋液中各菌株的孢子分散力均呈現隨乳化劑濃度的提高而上升的趨勢。在同一乳化劑濃度下，不同菌株間的孢子分散力差異極顯著。在高濃度乳化劑(5.5％)作用下，孢子疏水性偏低的菌株(Pf6032、Bb2860和Pf3076)在水相中的孢子分散力均超過50％，能滿足田間害蟲防治的常規(guī)噴霧需要。其中，Pf6032的孢子分散力最佳，幾近100％；而一株金龜子綠僵菌大孢變種(Mam978)的孢子分散率最低，僅6.1％。
　　 各

12、菌株不同配方懸乳劑的100倍稀釋液中的孢子分散力隨乳化劑濃度變化的趨勢，很好地擬合邏輯斯蒂方程(0.93≤r2≤0.99，P<0.0001)。其中，擬合參數中的孢子分散速率rd與所測6株菌的孢子疏水率之間顯著逆相關(r2=0.94)，說明疏水性的高低決定了孢子分散速率變化的94％。這一結果表明，疏水性越高的菌株，其懸乳劑的乳化效果越差，孢子越難被分散到水中，需要更高比例的乳化劑才能保證相間應用效果。
　　 綜上所述，本研究的主要