25203.產(chǎn)酶溶桿菌生防相關(guān)基因的克隆、功能分析及工程菌構(gòu)建

1、南京農(nóng)業(yè)大學博士學位論文產(chǎn)酶溶桿菌生防相關(guān)基因的克隆、功能分析及工程菌構(gòu)建姓名：錢國良申請學位級別：博士專業(yè)：植物病理學指導教師：劉鳳權(quán)20091201產(chǎn)酶溶桿菌生防相關(guān)基因的克隆、功能分析及工程菌構(gòu)建名為OHllH和OHllB。在LA平板上，野生型OHll產(chǎn)生黃色素，菌落為黃色。色素突變株OHllH可以產(chǎn)生可溶性的黑色素，但其菌落仍為黃色；OHllB茵落形態(tài)為白色，缺失了黃色素的合成。通過任意PCR和亞克隆技術(shù)，鑒定了轉(zhuǎn)座子在OHll

2、H和OHllB中的插入位點分別為hmgA基因和acp基因。hmgA基因編碼尿黑酸1，2加氧化酶，參與酪氨酸的代謝。而acp基因編碼3羰基(酰基載體蛋白)合成酶I，與脂肪酸生物合成(FAS)相關(guān)。在前期以幽謝基因作為報告基因篩選自殺載體的基礎(chǔ)上，本研究再次以hmgA為報告基因，驗證不同類型的自身載體在OHll中完成基因定向敲除的可行性，并再次確認在參試的自殺載體中，只有pEXl8GM才能完成靶標基因的定向缺失敲除，與前期篩選結(jié)果一致。通過

3、同源重組技術(shù)，分別構(gòu)建了hmgA和acp的定向敲除突變株，并明確hmgA的突變改變了OHll的細胞形態(tài)，使細胞從棍棒狀變?yōu)闄E圓狀，但不改變茵落形態(tài)；提高了OHll生物膜形成能力、在水稻葉片上的定殖能力及對水稻紋枯病的防效，但不改變OHII胞外多糖形成能力、4種胞外酶的產(chǎn)生能力和平板拮抗活性。明確了acp的突變不改變OHll的細胞形狀，但使細胞周圍“多糖”類物質(zhì)增加，降低了OHll生物膜形成能力，在水稻葉片上的定殖能力及對水稻紋枯病的防效

4、，同樣不改變OHll胞外多糖形成能力、4種胞外酶的產(chǎn)生能力和平板拮抗活性。此外，還初步明確了可溶性黑色素和茵體自身的黃色素可能與細茵抵御紫外光損傷無關(guān)。結(jié)合表型篩選和驗證，從OHll的突變株文庫中篩選到5株胞外多糖(exopolysacchide，EPS)缺失突變株，分別命名為MEPSlMEPS5。在LAS培養(yǎng)基上，野生型OHll菌落黃色、飽滿、光滑，而EPS缺失突變株茵落干燥、皺縮，但菌落仍為黃色。通過任意PCR技術(shù)(arbitrar

5、yPCR)，快速鑒定了轉(zhuǎn)座子在MESlMES5中的插入位點分別為別是tonB基因、透性酶(permease)編碼基因、IV分泌系統(tǒng)中Pilin蛋白編碼基因，以及未知蛋白編碼基因，表明眾多基因參與了EPS的合成。在任意PCR的基礎(chǔ)上，進一步通過亞克隆技術(shù)(subcloning)，克隆了tonB的完整基因。通過同源重組技術(shù)，構(gòu)建了tonB定向缺失突變株，并明確tonB的突變降低了OHll的滑行能力，改變了OHll的茵落形態(tài)，但不改變菌體細胞

6、形態(tài)；降低了OHll生物膜形成能力、在水稻葉片上的定殖能力及對水稻紋枯病的防效。初步明確了EPS可能與產(chǎn)酶溶桿菌抵御紫外光損傷相關(guān)。利用大腸桿菌中的組成型強啟動子P切實現(xiàn)了外源基因即AHL類信號分子降解基因aiiA在產(chǎn)酶溶桿菌OHll中的重組表達，構(gòu)建了抗生素標記的工程菌株OHllA。菌株OHllA能顯著降解不同植物病原細菌產(chǎn)生的AHL類信號分子。在離體生防試驗中，OHllA能大幅度降低軟腐病菌對大白菜的致病性，但不抑制軟腐病菌在寄主組