中性植酸酶產(chǎn)生菌的篩選及基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、中性植酸酶不僅具有較好的熱穩(wěn)定性，有助于抵抗飼料制粒過程中高溫引起的酶失活，而且其酶促反應(yīng)最適pH在7.0～7.5之間，可有效彌補(bǔ)酸性植酸酶的不足。本研究篩選了中性植酸酶產(chǎn)生菌，優(yōu)化了其液態(tài)產(chǎn)酶參數(shù)，克隆與分析了其基因，在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了中性植酸酶原核和真核表達(dá)基因工程菌，旨在為中性植酸酶產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：
　　 1.中性植酸酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其液態(tài)產(chǎn)酶參數(shù)優(yōu)化
　　 通過平板初篩和搖瓶復(fù)篩，從

2、土壤中篩選出6株能夠分泌中性植酸酶的菌株，其中菌株ZJ-6顯示較高的活方。經(jīng)鑒定表明，菌株ZJ-6為地衣芽孢桿菌，其液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中最佳碳源為1％葡萄糖，氮源為0.1％硫酸銨，初始pH為7.5，最佳培養(yǎng)溫度為55℃。經(jīng)36h培養(yǎng)后，產(chǎn)酶水平達(dá)到最高，酶活為0.267U/ml，比活為0.701U/mg。
　　 2.地衣芽孢桿菌ZJ-6中性植酸酶基因克隆及序列分析
　　 通過PCR對(duì)地衣芽孢桿菌ZJ-6中性植酸酶基因(p

3、hyC)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一段長約1.2kb的特異性產(chǎn)物，并將其克隆到pUCm-T載體，構(gòu)建含有目的基因片段的重組質(zhì)粒pUCm-T phyC。序列分析表明，phyC基因全長1146bp，編碼381個(gè)氨基酸，5’端有一段編碼31個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列；不含有酸性植酸酶蛋白中均存在的高度保守的RHGXRXP和HD序列；與已報(bào)道的地衣芽孢桿菌(AY651979)、凝結(jié)芽孢桿菌(DQ346195)、枯草芽孢桿菌(AJ277890)、淀粉液化芽孢桿菌(

4、AY836773)和芽孢桿菌sp.DSll(BSU85968)中性植酸酶核苷酸同源性分別為99％、70％、67％、67％和67％，與所編碼蛋白同源性分別為99％、69％、65％、65％和64％。該酶蛋白成熟肽二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲占57.42％，折疊占40.29％，α-螺旋占2.29％；其三級(jí)結(jié)構(gòu)與模板蛋白lh61A(1.8A)同源性為68.2％。
　　 3.中性植酸酶基因工程菌株的構(gòu)建
　　 將地衣芽孢桿菌ZJ-6編碼的中

5、性植酸酶基因(phyC)定向插入到原核表達(dá)載體pET-30a(+)上，獲得的重組質(zhì)粒phyC-pET-30a(+)在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物( EPhyC5)經(jīng)Ni-NTA親和層析純化后比活為2.87U/mg。SDS-PAGE表明，EPhyC5相對(duì)分子量為42.86 kDa。
　　 將地衣芽孢桿菌ZJ-6中性植酸酶成熟肽基因(phyCm)以N-端融合方式插入到酵母表達(dá)載體pPIC9K上的α-因子信號(hào)肽編碼序列的

6、3’端，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-phyCm，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤氏酵母GSll5。經(jīng)MD/MM平板篩選、G418抗性篩選和酶活性測(cè)定，獲得20個(gè)陽性表達(dá)子(pPhyCm)，其中pPhyCm6活性最高。將pPhyCm6接種于BMMY培養(yǎng)基中，經(jīng)0.5％甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)96h，發(fā)酵上清液中重組中性植酸酶(PPhyCm6)比活為8.64U/mg。SDS-PAGE結(jié)果表明，PPhyCm6相對(duì)分子量為38.78kDa，與理論推算的分子量(38.7kDa)

7、相吻合。在巴斯德畢赤氏酵母中實(shí)現(xiàn)了有生物學(xué)活性中性植酸酶的分泌表達(dá)。
　　 4.重組酶及其親本酶的酶學(xué)性質(zhì)分析
　　 野生酶PhyC最適溫度和最適pH分別為55℃和7.0；在80℃、pH7.0條件下處理10min，殘余酶活為57.36％；在pH6.5-9.0，25℃條件下處理1h，殘余酶活均高于80％。EPhyC5最適溫度和最適pH分別為60℃和7.O;在80℃、pH7.0條件下處理10min，殘余酶活為68.26％；在

8、pH6.0-9.0，25℃條件下處理lh，殘余酶活均高于80％。PPhyCm6最適溫度和最適pH分別為60℃和7.5；在80℃、pH7.5條件下處理2min，殘余酶活為59.42％；在pH5.0-9.0，25℃條件下處理lh，殘余酶活均高于80％。
　　 重組酶EPhyC5和PPhyCm6在離子影響、底物特異性和Ca2+依賴性方面與親本酶PhyC基本一致。EDTA、Cu2+、Cd2+、Ba2+和Mn2+對(duì)酶活性均有顯著抑制作用；