植酸酶phyA基因活性中心密碼子的改造及基因工程菌培養(yǎng)條件的研究.pdf

1、采用PCR技術(shù)對(duì)來(lái)源于黑曲霉N25植酸酶phyA基因表達(dá)片段進(jìn)行定點(diǎn)突變,在不改變其所編碼氨基酸的情況下,選用畢赤酵母偏愛(ài)的密碼子對(duì)該基因最保守序列中81位和85位的Arg密碼子進(jìn)行同義突變,將突變基因克隆到puc18載體中,經(jīng)序列測(cè)定確認(rèn)后進(jìn)一步構(gòu)建了突變基因phyA<'m>的酵母表達(dá)載體pPIC9k-phyA<'m>,同時(shí)以未突變phyA基因的酵母表達(dá)載體pPIC9k-phyA作為對(duì)照,在同等條件下電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母,經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)和產(chǎn)物

2、的酶活測(cè)定,篩選出突變與未突變高酶活酵母轉(zhuǎn)化子各2株.對(duì)這4株酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern blotting分析,結(jié)果表明phyA基因以單交換方式單拷貝整合到了酵母染色體DNA中;表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析表明,重組酵母中的植酸酶能有效分泌和表達(dá),酶蛋白分子大小為70.15KD.酶活測(cè)定結(jié)果表明,經(jīng)密碼子優(yōu)化的突變重組酵母酶活力明顯高于未進(jìn)行優(yōu)化的重組酵母轉(zhuǎn)化子,經(jīng)密碼子優(yōu)化的突變重組酵母株P(guān)P-NPm-8于麥芽汁培養(yǎng)基中誘導(dǎo)36

3、h后酶活力可達(dá)47600U/ml,其活力比未優(yōu)化重組酵母株P(guān)P-NP-2(23667u/ml)提高了約1倍,比該課題組報(bào)道的PP-NP-5(22598 u/ml)提高了約1.1倍,連續(xù)傳10代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),該轉(zhuǎn)化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性.對(duì)突變植酸酶基因工程菌PP-NP<'m>-8的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究,確定了其最佳培養(yǎng)條件:將種齡為16h的工程菌液體種子,以3﹪接種量接種pH4.5的麥芽汁生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h后換為pH值為5.0、甲醇終

4、濃度為4﹪的麥芽汁高溫浸提液誘導(dǎo)培養(yǎng)36h后該菌株產(chǎn)酶量可達(dá)85067U/ml,比未優(yōu)化培養(yǎng)條件時(shí)提高了近一倍,比姚斌等報(bào)道的用BMGY/BMMY培養(yǎng)工程菌獲得的15656u/ml提高了4.4倍.同時(shí)對(duì)突變株P(guān)P-NP<'m>-8與未突變株P(guān)P-NP-5用麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基成本加以比較,PP-NP-5菌株的培養(yǎng)基成本與酶產(chǎn)量比價(jià)為0.0303元/100000U,突變株P(guān)P-NP<'m>-8培養(yǎng)基成本與酶產(chǎn)量比價(jià)為0.009元/1