高表達尿毒素分解酶基因工程菌的構建及酶活性測定.pdf

1、目的：將肌酐水解酶基因克隆入乳酸菌NICE表達系統(tǒng)及乳酸菌pMG36e表達系統(tǒng)，構建能高效表達肌酐水解酶的乳酸工程菌，使之能產生肌酐水解酶，并測定比較其產酶活性。
　　 方法：從斯氏假單胞菌A1501中提取基因組DNA，根據genbank上已知的固氮斯氏假單胞菌肌酐水解酶基因序列，設計引物PCR擴增肌酐水解酶基因片段，經測序鑒定后將其分別克隆入質粒pMG36e，PNZ8048構建成重組質粒pMG36e-Cr、PNZ8048-Cr

2、，并分別轉化大腸桿菌DH5α及MC1061，篩選鑒定，提取重組質粒PMG36e-Cr、PNZ8048-Cr，電穿孔轉化乳酸菌L.lactis NZ9000，篩選鑒定。制備基因工程菌粗酶液，進行SDS-PAGE分析，并測定粗酶液肌酐水解酶的活性。
　　 結果：
　　 1、以斯氏假單胞菌A1501基因組為模板PCR擴增的基因片段瓊脂糖電泳大小約0.76kb，與Genbank肌酐水解酶基因片段大小符合。
　　 2、構建

3、的含重組質粒pMD18-T-Cr1，pMD18-T-Cr2的大腸桿菌DH5α進行菌液PCR擴出0.76Kb大小片段與目的片段大小符合。提取重組質粒pMD18-T-Cr1以SpeⅠ和HindⅢ雙酶切，pMD18-T-Cr2用SalⅠ和HindⅢ雙酶切，兩酶切產物電泳均示酶切片段大小為2.7Kb、0.76Kb與預期符合?；驕y序結果比對示克隆片段序列與Genbank(序列號CP000304.1)肌酐水解酶基因序列完全一致。
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4、、成功構建含pMG36e-Cr、PNZ8048-Cr的重組乳酸菌，提取重組質粒pMG36e-Cr、PNZ8048-Cr以質粒為模板PCR擴出0.76Kb大小片段與目的片段大小符合。PMG36e-Cr以SalⅠ和HindⅢ雙酶切得片段大小為3.6Kb、0.76Kb與預期符合，PNZ8048-Cr以SpeⅠ和HindⅢ雙酶切得片段大小為3.3Kb、0.76Kb與預期符合。
　　 4、粗酶液經不連續(xù)SDS-PAGE分析，重組乳酸菌表達

5、重組蛋白的分子量約為27KD，與由肌酐水解酶253個氨基酸計算的理論分子量相符。經粗酶液活性測定，斯氏假單胞菌A1501粗酶液活性為0.32u/ml，L.lactis-pMG36e-Cr的基因重組乳酸菌酶活性0.24 u/ml；L.lactis-PNZ8048-Cr的基因重組乳酸菌的酶活性為1.24 u/ml，較斯氏假單胞菌A1501及L.lactis-pMG36e-Cr明顯升高。
　　 結論：利用乳酸菌NICE系統(tǒng)成功構建了高