耐熱淀粉酶基因工程菌的表達及應(yīng)用.pdf

1、本次研究的耐熱淀粉酶是一種特殊的淀粉改良劑，他們與一般的淀粉酶不同是，對可溶性淀粉、支鏈淀粉、β-環(huán)化糊精等多種底物都具有轉(zhuǎn)糖基和降解作用，水解生成具有保健作用的麥芽糖或潘糖。本課題在已有耐熱淀粉酶基因工程菌的基礎(chǔ)上分別用乳糖和IPTG誘導(dǎo)來研究該酶的表達條件，然后研究酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)，最后研究了溫控型耐熱淀粉酶基因工程菌的表達條件，為該酶的工業(yè)化應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。
　　 1.論文首先對耐熱淀粉酶基因工程菌培養(yǎng)條件進行了研究

2、，該工程菌培養(yǎng)基經(jīng)過優(yōu)化分析后得到LB培養(yǎng)基為最佳表達培養(yǎng)基。其最佳表達條件：菌濃OD600為0.6、IPTG濃度達到0.6mmol/l、pH為6.0、誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時間5h。
　　 2.其次，對耐熱淀粉酶基因工程菌誘導(dǎo)劑組分進行了研究。在乳糖單獨誘導(dǎo)時該重組耐熱淀粉酶的最佳表達條件為乳糖濃度為0.5％(g/100ml)，菌濃為3.0、誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時間為5h、pH5.0，其酶活僅是IPTG單獨誘導(dǎo)時酶活的10％

3、，因此不能由乳糖來取代IPTG的誘導(dǎo)；乳糖與IPTG共同誘導(dǎo)麥芽糖基淀粉酶的最佳表達條件為乳糖濃度為0.5％(g/100ml)、IPTG濃度為0.2mmol/l、菌濃為2.0、誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時間為4h、pH7.0、其IPTG的用量是IPTG單獨誘導(dǎo)時的1/3，酶活達到由單獨IPTG誘導(dǎo)酶活的80％，因此IPTG與乳糖共同誘導(dǎo)可以取代由IPTG單獨誘導(dǎo)。
　　 3.再次，對表達出來的重組耐熱淀粉酶進行了分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研

4、究。通過重組耐熱淀粉酶在基因表達是帶有GST融合蛋白標簽的特點，利用GST柱純化了該重組酶，該純化酶的活性很高，達到12000U/g，其分子量為90kDa。該重組酶的最佳反應(yīng)溫度為60～70C，將該重組酶分別置于35℃和4℃保藏并定期取樣測量酶的剩余活力，發(fā)現(xiàn)酶在35℃放置3天后其剩余活力為原來的50％；在4℃下，保藏2周后酶活下降一半。該重組酶最適pH5.4～7.8，且pH值穩(wěn)定性較好。該重組酶寬廣的耐熱性、較寬的pH穩(wěn)定性為酶在工業(yè)

5、上的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。
　　 4.論文的第四個研究內(nèi)容是對該重組耐熱淀粉酶的催化產(chǎn)物進行了研究。經(jīng)過HPLC luna NH2柱檢測發(fā)現(xiàn)耐熱淀粉酶與以淀粉為底物以及與以β-環(huán)狀糊精為底物進行催化反應(yīng)所得產(chǎn)物均是麥芽糖和葡萄糖。對水解β-環(huán)狀糊精的機理研究發(fā)現(xiàn)，該重組耐熱淀粉酶是先打開β-環(huán)狀糊精的環(huán)，然后以麥芽糖為一個單位進行水解，最后的產(chǎn)物為麥芽糖與葡萄糖，其比例為3∶1；在耐熱淀粉酶的應(yīng)用上，將酶固定化后通過控制反應(yīng)時間可以制

6、備低聚糖；其與β-環(huán)狀糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶協(xié)同反應(yīng)降解淀粉時，兩者的配比為：在耐熱淀粉酶酶活的酶活為50U/ml，β-環(huán)狀糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶酶活為2000U/ml時，體積比為2∶1混合，反應(yīng)溫度為40-50℃，反應(yīng)pH為7.0時與催化淀粉效果最好。
　　 5.論文最后優(yōu)化了溫控型耐熱淀粉酶基因工程菌的表達條件。通過優(yōu)化得出溫控型耐熱淀粉酶工程菌最佳表達條件為：發(fā)酵溫度為30-32℃，pH6.0，菌濃為OD600為1.2，誘導(dǎo)溫度為：3