LR3-IGF-I基因工程菌的構建、表達及純化.pdf

1、IGF-Ⅰ是一種多功能細胞增殖調控因子，是由70個氨基酸組成的單鏈堿性多肽，主要由肝臟合成、分泌，具有胰島素樣合成代謝作用和促生長作用;LR3-IGF-Ⅰ在IGF-Ⅰ N端添加了十三個氨基酸，并且把IGF-Ⅰ的第三位Glu(E)用Arg(R)代替，在1992年由Francis GL等人在大腸桿菌中高效表達， LR3-IGF-Ⅰ比IGF-Ⅰ活性高，體內半衰期也延長，當前用LR3-IGF-Ⅰ做醫(yī)學研究、延緩衰老、健美等，有巨大的市場需求。但

2、國際上尚無廉價的LR3-IGF-Ⅰ產品，應用基因工程技術生產LR3-IGF-Ⅰ將會推動LR3-IGF-Ⅰ的基礎研究和應用。
　　本論文分三部分:
　　第一部分:利用基因克隆方法設計并合成引物，利用實驗室保存的IGF-Ⅰ表達質粒pExSecⅠ-IGF-Ⅰ在體外經PCR擴增得到重組表達質粒pExSecⅠ-LR3-IGF-Ⅰ，將重組質粒轉入Ecoli.BL21進行篩選，得到穩(wěn)定的LR3-IGF-Ⅰ原核表達系統(tǒng)。將基因工程菌在37℃

3、培養(yǎng)，IPTG誘導后，LR3-IGF-Ⅰ以包涵體形式大量表達。
　　第二部分:通過梯度實驗對LR3-IGF-Ⅰ在基因工程菌中的表達條件進行了優(yōu)化，對發(fā)酵培養(yǎng)基進行了改進，對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化;優(yōu)化后的表達條件下所得包涵體中目的蛋白表達量最高為46.97％，五升發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)可得到含目的蛋白20％左右的包涵體13g。
　　第三部分:將發(fā)酵所得包涵體進行變性，對不同的復性方法進行比較，確定一步稀釋法回收率較高;對不同的純化途徑

4、進行了比較，確定通過Sephadex G-50和SP Sepharose Fast Flow兩步純化，可得到電泳純的目的蛋白。純化所得目的蛋白經反相HPLC分析純度達98％，CCK-8法測定具有促進體外培養(yǎng)的小鼠NIH-3T3成纖維細胞增殖的生物學活性。
　　本論文初步得到一條在回收率和成本核算方面均具有可行性的LR3-IGF-Ⅰ規(guī)?；a工藝路線，下一步的工作目標是對已建立的工藝路線進行進一步的優(yōu)化，為LR3-IGF-Ⅰ的產業(yè)化