3-羥基丙醛影響克雷伯氏菌代謝及基因工程菌的構(gòu)建研究.pdf

1、1,3-丙二醇(PDO)是一種重要的化工原料，其最主要的用途是合成性能優(yōu)異的新型聚酯聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的重要單體，近年來，以生物柴油的副產(chǎn)物甘油生產(chǎn)高附加值的1，3-丙二醇，已成為提升生物柴油產(chǎn)業(yè)鏈經(jīng)濟(jì)性的重要途徑。
　　本論文從3-羥基丙醛(3-HPA)積累對(duì)克雷伯氏菌生理代謝的影響入手，探討了3-HPA對(duì)克雷伯氏菌PDO代謝的影響。當(dāng)甘油濃度為70g/L時(shí)，高濃度3-HPA積累，導(dǎo)致發(fā)酵異常終止。鹽酸氨基脲可誘導(dǎo)3

2、-HPA的合成，考察了不同濃度鹽酸氨基脲對(duì)克雷伯氏菌發(fā)酵的影響。低濃度鹽酸氨基脲可以誘導(dǎo)發(fā)酵過程中3-HPA濃度有小幅度提高，并促進(jìn)克雷伯氏菌菌體生長(zhǎng);當(dāng)鹽酸氨基脲濃度高于10mmol/L，3-HPA在發(fā)酵液中高濃度積累，發(fā)酵異常終止。
　　本文還考察了3-HPA積累對(duì)克雷伯氏菌PDO合成關(guān)鍵酶及輔酶的影響。在高濃度(7.05mmol/L)3-HPA積累時(shí)，甘油脫水酶活力較低濃度時(shí)（2.45mmol/L）提高一倍，甘油脫氫酶活力降

3、低了33.33％，PDO氧化還原酶活力降低37.5％。因此，細(xì)胞內(nèi)3-HPA合成速率加快，而被轉(zhuǎn)化為PDO的速率降低而導(dǎo)致3-HPA積累。在高濃度3-HPA積累時(shí)，發(fā)酵液中NADH2僅為低濃度3-HPA時(shí)的38.49％，同時(shí)NAD+升高了43.36％，還原力不足也是導(dǎo)致PDO合成受阻，發(fā)酵終止的另一重要原因。
　　在考察了3-HPA積累對(duì)克雷伯氏菌生理代謝影響的基礎(chǔ)上，以提高克雷伯氏菌對(duì)3-HPA耐受性為思想基礎(chǔ)，將聚羥基丁酸路徑

4、引入克雷伯氏菌中，構(gòu)建了新型基因工程菌，在發(fā)酵過程中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，工程菌中檢測(cè)到了PHB，優(yōu)化的IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5mmol/L。初始甘油濃度為70 g/L時(shí)，野生菌由于高3-HPA積累而發(fā)酵終止，而工程菌K.P/pCAB可耐受高濃度3-HPA，正常發(fā)酵生產(chǎn)PDO。發(fā)酵72h時(shí)，PDO產(chǎn)量可達(dá)31.30g/L，較野生菌增加了39.71％，其PDO得率為43.89％。
　　本研究有助于加深對(duì)克雷伯氏菌1，3-丙二醇代謝機(jī)理的