以甘油為底物構(gòu)建肺炎克雷伯氏重組菌生產(chǎn)3-羥基丙酸.pdf

1、3-羥基丙酸(3-HP)是一種重要的平臺化合物，其生物合成方法與工業(yè)化程度引起了廣泛的重視。本文選取具有高濃度甘油耐受力的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)作為3-HP的生產(chǎn)宿主，以K.pneumoniae的組成型啟動子分別構(gòu)建了醛脫氫酶基因ald4與甘油脫水酶基因dhaB的串聯(lián)共表達(dá)質(zhì)粒pKP-28a-AB，經(jīng)SDS-PAGE分析，重組菌的關(guān)鍵酶基因得以有效表達(dá)。搖瓶批式發(fā)酵顯示，重組菌K. pneumoni

2、ae(pKP-28a-AB)在有氧條件下，3-HP產(chǎn)量為0.336 g·L-1，甘油轉(zhuǎn)化率為0.1(mol·mol-1 glycerol)。
　　 以關(guān)鍵酶共表達(dá)質(zhì)粒pKP-28a-AB，分別轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇高產(chǎn)菌株K.pneumoniae K2與乳酸脫氫酶基因敲除菌株K. pneumoniae Kp5-3，獲得的重組菌K2-AB與Kp5-3-AB經(jīng)初步發(fā)酵分析顯示，重組菌K2-AB在小試條件下的3-HP產(chǎn)量為3.09 g·L

3、-1，甘油轉(zhuǎn)化率為0.68(mol·mol-1 glycerol)，相比已構(gòu)建的重組菌具有最高的3-HP生成量；重組菌Kp5-3-AB的搖瓶批式發(fā)酵結(jié)果顯示，3-HP濃度相比對照菌株提高了～1倍，乳酸濃度降低了～1倍。
　　 建立了兩種消除K. pneumoniae重組型質(zhì)粒的方法：連續(xù)傳代法與SDS法。其中，用0.2％SDS復(fù)合Ca2+處理K. pneumoniae，能有效消除其重組型質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒消除菌可再次導(dǎo)入新的質(zhì)粒。

4、利用建立的質(zhì)粒消除方法，初步研究了抗性脅迫條件對重組菌生產(chǎn)3-HP的影響，發(fā)酵分析顯示，新構(gòu)建的重組菌3-HP生成量相比同基因型的對照菌株提高了24.57％。
　　 利用合成生物學(xué)領(lǐng)域新興的應(yīng)用，設(shè)計(jì)了構(gòu)建“細(xì)胞工廠”的五個通用研究步驟。將DNA組裝技術(shù)引入實(shí)驗(yàn)，以Polymerase cycling assembly(PCA)的方法研究質(zhì)粒構(gòu)建的問題，并依靠兩個線性DNA片段構(gòu)建出～4.5kb的完整質(zhì)粒，為實(shí)現(xiàn)快速有效的非連接