3-羥基丙酸合成過程中關(guān)鍵途徑的構(gòu)建及優(yōu)化.pdf

1、3-羥基丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HP）是乳酸的羥基異構(gòu)體，是合成很多醫(yī)藥化工中間體的重要前體物質(zhì)，具有廣泛的應(yīng)用前景。但目前生物法利用甘油合成3-HP最主要的問題是其產(chǎn)量還未達(dá)到工業(yè)化水平，因此構(gòu)建性能優(yōu)良的基因工程菌株是目前的主要研究方向。本研究以大腸桿菌Escherichia Coli BL21(DE3)為出發(fā)菌株，構(gòu)建了合成3-HP的代謝路徑，引入了甘油脫水酶再激活因子GDR和輔酶NAD+再生途徑

2、，并在基因組上為合成乙酰CoA的基因acs更換了trc強(qiáng)啟動(dòng)子，最后對構(gòu)建的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)3-HP能力進(jìn)行了考察，具體研究內(nèi)容如下:
　　1.克隆來源于Klebsiella pneumoniae DSM2026甘油脫水酶基因dhaB及再激活因子基因gdrA，采用不同的表達(dá)載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒pETDuet-dhaB1-4、pET28a-dhaB1-4和口pCDFDuet-dhaB1-4;E.coli BL21(DE3)(pET-

3、28a-dhaB1-4/pETDuet-dhaB1-4/pCDFDuet-dhaB1-4)甘油脫水酶酶活依次為11.56U/mg、7.94U/mg和6.94U/mg。同時(shí)克隆表達(dá)來自Cupriavidus necator的醛脫氫酶基因GabD4，得到重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-GABab D4。與實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的含有Azospirillum brasilense的內(nèi)源性基因α-酮戊二酸半醛脫氫酶的重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-

4、Tukgsadh比較，酶活分別為E.coli BL21(DE3)pCDFDuet-tac-TUkgsadh:3.11U/mg,E.coli BL21(DE3)pCDFDue-tac-GabD4:1.71U/mg。共表達(dá)得到工程菌株E.coli BL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pET-28a-dhaB1-4)、E.coli BL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-dh

5、aB1-4)、E.coli BL21(DE3)(pCDFDue-tac-GabD4/pET28a-dhaB1-4)和E.coliBL21(DE3)(pCDFDuet-tac-GabD4/pETDuet-dhaB1-4)。在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)38h，3-HP的最高產(chǎn)量分別為0.37g/L、1.14g/L、0.31g/L和0.86g/L。說明使甘油脫水酶和醛脫氫酶分別在不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒上表達(dá)來平衡二者的酶活，更適合3-HP的合成。

6、　　2.為提高3-HP的產(chǎn)量，進(jìn)一步優(yōu)化了其合成途徑，包括甘油脫水酶再激活因子和輔酶NAD+再生途徑的引入以及乙酰CoA啟動(dòng)子的更換。克隆來源于K.pneumoniae DSM2026中的甘油脫水酶再激活因子基因gdrB，構(gòu)建了E.coli BL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-tac-dhaB-gdrAB)，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)38h后3-HP產(chǎn)量提高到5.12g/L，相較之前提高了4.5倍

7、。與前期構(gòu)建的輔酶再生的串聯(lián)重組質(zhì)粒pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh和pCD FDuet-tac-sthA-TUkgsadh共表達(dá)后，搖瓶發(fā)酵38h后，結(jié)果顯示添加了輔酶再生基因后的工程菌，3-HP的產(chǎn)量反而降低，通過分析發(fā)現(xiàn)3-HP產(chǎn)量降低的主要原因是表達(dá)sthA和gpd1兩個(gè)基因后，由于代謝途徑中氧化還原力的不平衡導(dǎo)致途徑中缺乏NAD+，從而降低了醛脫氫酶的活性。除此之外，乙酰CoA合成過程中可以通過三羧酸循環(huán)經(jīng)

8、氧化磷酸化釋放出大量的ATP供細(xì)胞生長和物質(zhì)合成，因此本實(shí)驗(yàn)采用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)將合成乙酰CoA基因acs的啟動(dòng)子替換為trc強(qiáng)啟動(dòng)子，構(gòu)建了E.coli BL21(DE3)T(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-tac-dhaB-gdrAB)，該工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)38h后，3-HP產(chǎn)量達(dá)到5.5g/L，菌株生長狀況良好，提前達(dá)到了穩(wěn)定期。
　　3.以工程菌E.coli BL21(DE3)T

9、(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-tac-dhaB-gdrAB)為出發(fā)菌株，優(yōu)化了5L發(fā)酵罐中3-HP的發(fā)酵工藝，發(fā)酵過程中控制pH穩(wěn)定在7.0，3-HP產(chǎn)量為8.79g/L，比pH不控制的情況提高了68％。在pH恒定為7.0的基礎(chǔ)上，在甘油濃度下降至15g/L時(shí)開始添加，并維持甘油濃度在15-20g/L之間，發(fā)酵結(jié)束后3-HP產(chǎn)量達(dá)到12.11g/L。相比未補(bǔ)加甘油提升了38％。在此基礎(chǔ)上每隔12小時(shí)補(bǔ)加一