聚3-羥基丙酸重組菌構(gòu)建及代謝調(diào)控.pdf

1、聚3-羥基丙酸(P3HP)是一種極具開發(fā)前景的聚羥基脂肪酸(PHA)。P3HP作為新型高分子生物材料，其不僅具有良好的生物兼容性、可降解性和較高剛性，還具較好延展性和拉伸性能等，被視為塑料最佳替代品。目前，自然界中尚未發(fā)現(xiàn)能夠天然合成P3HP的微生物，且P3HP化學(xué)合成存在很大局限性，因此，利用微生物法生產(chǎn)P3HP尤為迫切。本課題選取肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniaeMGH78578)為宿主，甘油為底物，通過甘油

2、脫水酶(DhaB)、輔酶A依賴的丙醛脫氫酶(PduP)和PHA合酶(PhaC)的催化完成P3HP的積累。研究以下內(nèi)容:
　　1、成功克隆了來源于羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha H16)的phaC1和來源于集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)的phbC，構(gòu)建了兩株重組菌K.p(pET-pk-phaC1)和K.p(pET-pk-phbC)，發(fā)酵檢測(cè)兩重組菌中并無可測(cè)P3HP產(chǎn)生，推測(cè)可能由于P

3、3HP前體物不足導(dǎo)致，需要強(qiáng)化前體物濃度。
　　2、克隆來源于K.pneumoniae和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellaenterica serovar Typhimurium LT2)輔酶A依賴的丙醛脫氫酶基因(pduPKp與pduPSe)并在K.pneumoniae中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PduPse能夠高效表達(dá)，其酶活為2.03 U/mg，相比于對(duì)照菌(K.pneumoniae與K.p(pET-pk))分別提高了7.58倍和5.31

4、倍。pduPSe基因超表達(dá)對(duì)宿主菌生長(zhǎng)、甘油消耗以及代謝流量產(chǎn)生了影響。重組菌K.p(pET-pk-pduPSe)能高效轉(zhuǎn)化有害中間產(chǎn)物3-羥基丙醛，使得生物量的提高;且能夠重排碳代謝流。
　　3、構(gòu)建了P3HP重組菌株K.p(pE T-pk-pduPSe-phaC1)和K.p（pET-pk-pduP Se-phbC），研究PduP和PHA合酶串聯(lián)表達(dá)重組菌P3HP的積累。結(jié)果表明，pduPSe與phaC1串聯(lián)表達(dá)未明顯增加宿主菌

5、生長(zhǎng)負(fù)荷，而不同來源的PHA合酶基因?qū)λ拗骶锪坑绊懢哂胁町悺Ｖ亟M菌K.p(pET-pk-pduPSe-phaC1)代謝甘油速率較平穩(wěn)，24h時(shí)甘油剩余量為14.26 g/L，與對(duì)照菌比甘油消耗速率能力有所降低;重組菌K.p(pET-pk-pduPSe-phbC)24 h時(shí)甘油剩余量為18.89 g/L，其甘油代謝能力低于重組菌K.p(pET-pk-pduPSe-phaC1)。
　　4、為探究代謝流分向?qū)3HP合成的影響，構(gòu)建

6、了dhaT基因敲除的重組重組菌株K.p(pET-pk-pduPSe-phaC1-△dhaT)和K.p(pET-pk-pduPSe-phbC-△dhaT)。結(jié)果表明，該重組菌株生長(zhǎng)減慢，甘油消耗速率大幅降低，表明dhaT敲除后并沒有消除1，3-丙二醇代謝途徑對(duì)P3HP合成的影響，反而干擾了甘油代謝網(wǎng)絡(luò)。該改造策略不利于P3HP積累。成功用tac啟動(dòng)子替換原載體中pk啟動(dòng)子，構(gòu)建重組菌K.p(pET-tac-pduPSe-phaC1)和K.