生物柴油基因工程菌的構建.pdf

1、生物柴油具有可完全燃燒、再生降解等優(yōu)點，已受到許多國家的高度關注與重視。目前，生物柴油主要為由長鏈脂肪酸與短鏈醇反應生成的重質型生物柴油，其生產原料主要來源于動植物油脂，存在著與人爭糧的局面且價格較高，是制約生物柴油發(fā)展的重大因素。因此尋找廉價易得原料并利用非食用油脂合成輕質生物柴油是未來的發(fā)展方向。隨著生物學的發(fā)展，通過基因工程手段控制已有微生物脂肪酸代謝途徑合成性能優(yōu)良的輕質型生物柴油是生物柴油發(fā)展的趨勢。所以利用基因工程菌發(fā)酵生產

2、輕質生物柴油具有重要的現實意義。
　　 本文主要研究工作如下:
　　 (1)大腸桿菌中調控脂肪酸代謝關鍵硫酯酶基因的研究，以大腸桿菌K-13的基因組為模板擴增硫酯酶基因(tesA')，構建該基因在大腸桿菌中的同源表達系統(tǒng)pETDuet-tesA'，并在大腸桿菌BL21中表達。通過蛋白電泳在預測分子量21KDa處獲得極微量目的條帶，效果不是很明顯。
　　 (2)萼距花屬、月桂樹和香樟樹三種植物中調控脂肪酸代謝關鍵特

3、異性硫酯酶基因的研究，以經密碼子優(yōu)化后化學合成的三種硫酯酶基因為模板，設計不同引物和酶切位點PCR擴增得到不同特異性的硫酯酶基因:chFatB，ucFatB，ccFatB。分別構建了這三個基因在大腸桿菌中的異源表達系統(tǒng)pETDuet-chFatB，pETDuet-ucFatB，pETDuet-ccFatB，并在大腸桿菌BL21中進行表達得到工程菌 pDchFatB，pDucFatB，pDccFatB。這三個表達系統(tǒng)通過蛋白電泳在33KD

4、a處獲得了目的條帶，工程菌pDchFatB成功地使大腸桿菌生成172mg/L的脂肪酸，同空白對照菌190mg/L的產量相比，產量沒有提高，但在脂肪酸種類上生成了C8、C10的特異性中鏈脂肪酸;pDucFatB成功地使大腸桿菌生成473mg/L的脂肪酸，同空白對照菌相比，產量有明顯提高，是空白對照菌產量的2.5倍，且在脂肪酸的種類上，工程菌產生了中鏈的C10、C12、C14的脂肪酸;pDccFatB成功地使大腸桿菌生成234mg/L的脂肪

5、酸，同空白對照菌相比，產量有一定提高，比空白對照菌產量提高了23.2％，且在脂肪酸的種類上，工程菌產生了中鏈的C14的脂肪酸。
　　 (3)產輕質生物柴油基因工程菌的構建，以不動桿菌ADP1基因組為模板擴增得到高度非特異性的?；D移酶基因atfA，構建該基因在大腸桿菌中不同的雙基因異源表達系統(tǒng)pETDuet-chFatB-atfA，pETDuet-ucFatB-atfA，pETDuet-ccFatB-atfA，并在大腸桿菌BL2

6、1中進行表達得到工程菌pDchA，pDucA，pDccA。工程菌pDchA通過蛋白電泳在41KDa處只有極微量的目標條帶，其余兩個工程菌pDucA和pDccA通過蛋白電泳在41KDa處有很明顯的目標蛋白條帶。pDchA未能成功地使大腸桿菌生成中鏈脂肪酸乙酯;pDucA成功地使大腸桿菌生成7.6mg/L的脂肪酸乙酯，而空白對照菌中無脂肪酸乙酯的生成，且在脂肪酸乙酯的種類上，工程菌產生了中鏈的C12、C14的中鏈脂肪酸乙酯;pDccA成功地

7、使大腸桿菌生成6mg/L的脂肪酸乙酯，而空白對照菌中無脂肪酸乙酯的生成，且在脂肪酸乙酯的種類上，工程菌產生了中鏈的C14的中鏈脂肪酸乙酯。最后進一步的分析表明pDucA和pDccA工程菌胞內仍存在8.5mg/L與8.7mg/L的脂肪酸未在?；D移酶的作用下與乙醇反應生成相應的脂肪酸乙酯。所以后續(xù)優(yōu)化乙醇流加量(1％-5％)，最終得出最佳的乙醇流加量為3％。
　　 (4)產乙醇基因工程菌的構建，以克雷伯氏菌基因組為模板擴增得到丙酮

8、酸脫羧酶(PDC1)和乙醇脫氫酶(AdhE)，構建這兩個基因在大腸桿菌中單基因與雙基因表達系統(tǒng)pETDuet-PDC1、pETDuet-PDC1-AdhE，并在大腸桿菌BL21中進行表達。單基因表達系統(tǒng)通過蛋白電泳在61KDa處有明顯的目標條帶，雙基因表達系統(tǒng)通過蛋白電泳在96KDa處有很明顯的目標蛋白條帶。發(fā)酵培養(yǎng)顯示單基因工程菌中乙醇產量為88mg/L，同空白對照菌株的產量75mg/L，提高幅度較小。雙基因工程菌最終發(fā)酵液中乙醇產量