絮凝性基因工程菌的構(gòu)建及絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選.pdf

1、微生物絮凝劑是由微生物分泌的生物活性物質(zhì),能對(duì)水中的懸浮顆粒產(chǎn)生絮凝沉降作用,且具有無(wú)毒無(wú)害、對(duì)環(huán)境無(wú)污染和可生物降解等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于食品和發(fā)酵工業(yè)、飲用水和廢水處理、工業(yè)下游加工等領(lǐng)域,引起了國(guó)內(nèi)外研究者廣泛的關(guān)注。
　　本研究從構(gòu)建絮凝性基因工程菌和選育絮凝劑產(chǎn)生菌兩方面對(duì)微生物絮凝劑進(jìn)行研究,主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.提取釀酒酵母基因組,利用PCR技術(shù)克隆絮凝基因FLO5,通過(guò)TA克隆連入pMD18-T Vecto

2、r,重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-FLO5,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,酶切及測(cè)序鑒定,回收FLO5基因片段,連接原核表達(dá)載體pET-22b和pET-28a,構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pET22b-FLO5、pET28a-FLO5,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),得到絮凝性基因工程菌株。對(duì)絮凝性基因工程重組菌株用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),大腸桿菌BL21/pET28a-FLO5表達(dá)了絮凝蛋白FLO5p。測(cè)定了絮凝重組大腸桿

3、菌BL21/pET28a-FLO5和BL21/pET22b-FLO5的絮凝活性,相比原始菌株分別提高了1.48倍和2.85倍。
　　2.從活性污泥中篩選到一株絮凝活性較高的絮凝劑產(chǎn)生菌,命名為A5菌株。對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)試及16S rDNA序列比對(duì)分析,鑒定該菌株屬于鞘氨醇桿菌屬。對(duì)該菌株的培養(yǎng)條件用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò) Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出了3個(gè)對(duì)菌株A5產(chǎn)絮凝劑影響較大的重要因子,分別為葡

4、萄糖含量、尿素含量和氯化鈉含量。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)篩選出的3個(gè)重要因子做進(jìn)一步優(yōu)化,確定最佳培養(yǎng)條件為:當(dāng)葡萄糖含量15.0g/L,尿素含量0.88g/L,氯化鈉含量0.13g/L時(shí),菌株A5的絮凝活性最高,最大絮凝率可達(dá)83.87％。檢測(cè)絮凝性基因工程菌大腸桿菌 BL21/pET28a-FLO5和 BL21/pET22b-FLO5與菌株 A5的混合菌液絮凝活性, BL21/pET28a-FLO5與菌株 A5混合比在1:2