可控裂解的產(chǎn)耐熱過氧化氫酶基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、過氧化氫酶是一種催化效率非常高的生化酶，在紡織、造紙、食品、醫(yī)藥、臨床等行業(yè)有著廣泛的用途。來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(株)的過氧化氫酶具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，但該菌株產(chǎn)過氧化氫酶水平很低。隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)在越來越多的外源蛋白都實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌宿主中的高水平表達(dá)外源重組蛋白在大腸桿菌中往往以胞內(nèi)產(chǎn)物的形式存在，很難分泌到胞外，目的蛋白的分離首先需要對菌體進(jìn)行破碎。將噬菌體溶菌酶基因克隆到宿主菌中，構(gòu)建可控裂解的基因工程菌是一種溫和

2、、可控、操作簡單的方法。 通過PCR方法擴(kuò)增得到嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)IAM11001(ATCC8005)過氧化氫酶的結(jié)構(gòu)基因perA，與帶強(qiáng)啟動子λPRPL的溫度控制表達(dá)載體pBV220連接后成功構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pBV-perA。將pBV-perA轉(zhuǎn)化到E.coliJM109中實(shí)現(xiàn)了過氧化氫酶基因的高表達(dá)。在LB培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基中考察了誘導(dǎo)時機(jī)和誘導(dǎo)時間對重組E.coliJ

3、M109(pBV-perA)產(chǎn)酶的影響。在LB培養(yǎng)基中當(dāng)誘導(dǎo)時機(jī)和誘導(dǎo)時間都為5h，產(chǎn)酶量最大，達(dá)到72.9U/mL；在半合成培養(yǎng)基中當(dāng)葡萄糖濃度為10g/L，誘導(dǎo)時機(jī)為4h，誘導(dǎo)時間為6h時，產(chǎn)酶最高，酶活達(dá)到131U/mL。 通過PCR方法定點(diǎn)誘變并擴(kuò)增得到溫度敏感的T4噬菌體溶菌酶基因ets，與表達(dá)載體pUC19連接后轉(zhuǎn)化E.coliJM109，得到重組菌株E.coliJM109(pUC19-ets)。重組菌在三角瓶中通過

4、添加IPTG誘導(dǎo)后，懸浮于裂解緩沖液bufferTE中，菌體在10min內(nèi)吸光度由1.75迅速下降到0.25左右，成功實(shí)現(xiàn)了可控裂解。將帶有SD序列的T4噬菌體溶菌酶基因ets插入pBV-perA質(zhì)粒perA基因下游上，重組質(zhì)粒pBV220-perA-ets轉(zhuǎn)化E.coliJM109，得到可控裂解的產(chǎn)過氧化氫酶基因工程菌。該重組菌在升溫誘導(dǎo)條件下，實(shí)現(xiàn)了過氧化氫酶基因和溶菌酶基因的共表達(dá)，發(fā)酵后成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的可控裂解。裂解液中蛋白濃度