產(chǎn)丁二酸基因工程菌的構(gòu)建及其厭氧發(fā)酵的初步研究.pdf

1、丁二酸，俗稱琥珀酸，作為一種常見的天然有機(jī)酸，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，許多厭氧微生物能夠生產(chǎn)丁二酸作為其能量代謝的主要末端產(chǎn)物。作為一種優(yōu)秀的C4平臺(tái)化合物，丁二酸可被廣泛應(yīng)用于制備藥物、精細(xì)化工產(chǎn)品以及可生物降解的聚合物。傳統(tǒng)化學(xué)法合成丁二酸以不可再生資源石油為原料，成本高，環(huán)境污染嚴(yán)重，嚴(yán)重阻礙了丁二酸作為大宗化學(xué)品的發(fā)展?jié)摿?。生物法轉(zhuǎn)化可再生資源生產(chǎn)丁二酸，成本低，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可吸收大量CO2用于菌體的代謝

2、，具有綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。
　　 本論文考察在編碼丙酮酸甲酸裂解酶基因pfl和乳酸脫氫酶基因ldh雙突變的E.coli中過量表達(dá)蘋果酸酶對(duì)其厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響。從E.coli DH5α基因組上通過PCR的方法擴(kuò)增出編碼蘋果酸酶的基因sfcA，將其連接至pGEM-T vector上，序列測(cè)定結(jié)果與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的E.coli K-12蘋果酸酶基因序列一致。將擴(kuò)增得到的sfcA基因，連接至載體pTrc99a上，構(gòu)建出表達(dá)載體p

3、Trc99a-sfcA，并轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli FMJ39、DC1500、NZN111以及DC1502中，選擇0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑濃度，30℃，200 rpm誘導(dǎo)8h后，超聲破碎細(xì)胞取上清液測(cè)定酶活力并進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明：測(cè)定的重組菌蘋果酸酶的比酶活在26.78～57.44 U/mg之間，比酶活比受體菌提高的倍數(shù)在87.37～161.52之間。SDS-PAGE分析的結(jié)果表明，在大約64 kDa位置上，有一明

4、顯的誘導(dǎo)表達(dá)條帶，與預(yù)測(cè)的sfcA分子量和文獻(xiàn)報(bào)道均一致。
　　 厭氧條件下考察了在上述宿主菌中過量表達(dá)蘋果酸酶對(duì)厭氧混合酸發(fā)酵途徑的影響，結(jié)果表明：除FMJ39以外，在宿主菌中過量表達(dá)蘋果酸酶，皆能夠重新恢復(fù)菌株在厭氧條件下的生長(zhǎng)能力，丁二酸是積累的主要有機(jī)酸，且其產(chǎn)量比宿主菌有了顯著提高。其中重組NZN111的丁二酸對(duì)葡萄糖質(zhì)量收率最高，當(dāng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加17.00 g/L初始葡萄糖時(shí)，厭氧發(fā)酵48 h后，葡萄糖完全消耗，

5、丁二酸的產(chǎn)量為8.96 g/L，丁二酸對(duì)葡萄糖的質(zhì)量收率為52.71％，其產(chǎn)酸性能在選擇的宿主菌中為最優(yōu)。重組NZN111發(fā)酵液中沒有檢測(cè)到甲酸和乳酸，有少量乙酸產(chǎn)生，丙酮酸也有部分積累。
　　 進(jìn)一步對(duì)重組NZN111厭氧發(fā)酵過程中使用的誘導(dǎo)劑IPTG濃度，好氧與厭氧切換時(shí)機(jī)、轉(zhuǎn)接方式進(jìn)行考察，結(jié)果表明：選擇IPTG終濃度為0.7 mmol/L，采用接入30 mL有氧培養(yǎng)菌泥的方式比按照10％接種量轉(zhuǎn)接對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期菌種(即O

6、D600為3.5左右)進(jìn)行厭氧發(fā)酵效果要好，丁二酸的質(zhì)量收率由69.18％提高到了72.93％，且20 g/L左右的葡萄糖消耗時(shí)間由48 h降低到36 h。重組NZN111葡萄糖耐受性實(shí)驗(yàn)表明：葡萄糖濃度在20-60 g/L之間時(shí)，重組NZN111菌體的生長(zhǎng)和丁二酸產(chǎn)量都較好，丁二酸的收率隨著葡萄糖濃度的增加而增加，為73.23-78.42％之間。當(dāng)葡萄糖濃度高于60 g/L時(shí)，對(duì)重組NZN111的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸都會(huì)有一定的抑制作用，且葡萄

7、糖濃度越高，抑制作用越明顯。5 L發(fā)酵罐上采用42.5 g/L的初始葡萄糖，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，丁二酸對(duì)葡萄糖的質(zhì)量收率為63.07％，厭氧發(fā)酵過程中葡萄糖消耗速率為0.51g/(L·h)，丁二酸的生產(chǎn)強(qiáng)度為0.25 g/(L·h)。
　　 為了進(jìn)一步提高丁二酸的質(zhì)量收率，研究中還選擇了NZN111的ptsG基因自發(fā)突變?nèi)笔Ь闍FP111為宿主菌，在其中過量表達(dá)蘋果酸酶，進(jìn)一步提高了丁二酸的質(zhì)量收率，達(dá)到了80.88％，發(fā)酵液中沒有檢