應用蛋白質拉氏圖信息提高谷氨酸脫羧酶催化性能的研究.pdf

1、谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD; EC4.1.1.15）能以磷酸吡哆醛(PLP)為輔酶專一性地催化L-谷氨酸脫羧合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyrate，GABA)，是生物催化法制備GABA的唯一酶。GABA是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，具有降血壓、鎮(zhèn)靜安神、改善睡眠和記憶力等多種重要的生理功能，在食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)、農業(yè)等領域都具有廣闊的應用前景。但由于天然的GAD存在酶活低、熱穩(wěn)定性差

2、的缺陷，在大規(guī)模生成GABA的應用中受到了很大的限制。本研究以短乳桿菌GAD為父本酶，利用拉氏圖獲取蛋白質結構信息，通過定點突變的方法對GAD進行分子改造。
　　首先，以熱穩(wěn)定性和活性為篩選目標，通過研究短乳桿菌GAD1407三維模擬結構的拉氏圖，確定不穩(wěn)定氨基酸殘基位點K413，采用定點突變的方法構建該位點的突變體，測定野生型酶和突變酶的熱穩(wěn)定性和活力。結果表明突變酶K413A和突變酶K413I分別在熱穩(wěn)定性和酶活力上獲得了提高

3、，突變酶K413A在50℃的半衰期為105 min，是野生酶的2.1倍;突變酶K413I熱穩(wěn)定性沒有明顯的提高，但其酶活力卻得到了有效提高，約為野生型的1.6倍。對突變酶K413A和突變酶K413I的酶學性質分析表明，兩種突變酶底物親和力(Km)與野生型酶相差不大，而突變酶K413A和突變酶K413I的轉化數(Km)分別是野生型酶的133％和167％。通過三維結構模型分析，發(fā)現突變酶對于催化活力和熱穩(wěn)定性的改善主要由于增加了蛋白質分子內

4、的疏水相互作用。
　　為了進一步比較突變酶K413A和野生型酶的熱穩(wěn)定性，以鹽酸胍和脲為變性劑，利用熒光檢測法對野生型酶和突變酶K413A的去折疊過程進行研究。結果表明:在激發(fā)波長為280 nm時，以鹽酸胍作為誘導劑時，兩種酶中色氨酸的最大發(fā)射峰都會發(fā)生紅移，色氨酸熒光強度呈現先上升再下降的趨勢;以脲作為誘導劑時，兩種色氨酸的最大發(fā)射峰也都會發(fā)生紅移，色氨酸熒光強度下降。突變酶K413A和野生型酶去折疊過程的熒光相圖檢測結果表明，

5、無論是以鹽酸胍還是脲作為誘導劑，兩種酶的去折疊過程都符合“三態(tài)模型”，說明隨著變性劑濃度的增加，野生型酶和突變酶K413A先從天然態(tài)轉變?yōu)椴糠终郫B中間態(tài)，并最終轉變?yōu)槿フ郫B狀態(tài)。此外，還考察了變性劑對酶活力的影響，當以鹽酸胍為變性劑時，野生型酶和突變酶K413A半失活的鹽酸胍濃度分別為0.4 mol/L和0.7 mol/L;當以脲為變性劑時，野生型酶和突變酶K413A半失活的脲濃度分別為1 mol/L和2 mol/L，由此可知，在變性劑