甲基轉(zhuǎn)移酶、精氨酸脫氨酶及乙酰乳酸脫羧酶的催化機(jī)理研究.pdf

1、酶是具有生物催化功能的高分子物質(zhì)，與傳統(tǒng)的催化劑相比，酶的催化效率更高、反應(yīng)條件更加溫和并且環(huán)保、無公害，在生物體的生命活動(dòng)中起到了不可替代的作用。研究酶的催化機(jī)理不僅有助于理解酶的生物學(xué)功能，還將為酶的實(shí)際應(yīng)用奠定必要的理論基礎(chǔ)。但酶催化的反應(yīng)通常速度很快，僅通過實(shí)驗(yàn)方法很難獲得酶催化反應(yīng)的詳細(xì)信息。近年來量子化學(xué)與計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展為研究生物大分子體系奠定了基礎(chǔ)。
　　本論文主要采用量子力學(xué)與分子力學(xué)相結(jié)合(QM/MM)的方法對(duì)

2、三種酶的催化反應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)的理論研究，在晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上構(gòu)建了合理的計(jì)算模型，確定了反應(yīng)的最佳路徑，分析了反應(yīng)中間體、過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，給出了反應(yīng)的能量學(xué)信息，在原子水平上詳細(xì)地闡明了酶催化反應(yīng)的機(jī)理。理論計(jì)算結(jié)果不僅有助于深入理解這些酶的催化反應(yīng)機(jī)理，還可為工業(yè)應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。本論文的主要工作如下:
　　(1)大腸桿菌中SAM甲基轉(zhuǎn)移酶催化機(jī)理的理論研究
　　甲基轉(zhuǎn)移酶(RlmN)屬于自由基SAM酶，它是一個(gè)雙重特

3、異性的酶，既可以催化23S rRNA上2503號(hào)腺苷的甲基化又可催化大腸桿菌中轉(zhuǎn)運(yùn)RNAs(tRNA)上37號(hào)腺苷C2的甲基化。本文以RlmN與大腸桿菌tRNA的復(fù)合物（PDB編碼:5HR6）的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)構(gòu)建了計(jì)算模型，并應(yīng)用QM/MM研究的甲基化反應(yīng)機(jī)理。計(jì)算結(jié)果表明RlmN催化腺苷C2原子的甲基化過程遵循自由基反應(yīng)機(jī)理，反應(yīng)總共包含四步基元反應(yīng)，5'-dA自由基首先奪取甲基化的半胱氨酸C355上的質(zhì)子，生成C'自由基，然后C'自

4、由基進(jìn)攻A37上的C2原子，生成蛋白質(zhì)-核苷酸交聯(lián)的中間體(IM2);在中間體IM2的分解過程中，C118殘基的奪質(zhì)子過程與C355殘基的C'-S'鍵斷裂是協(xié)同進(jìn)行的，C118殘基將氫原子轉(zhuǎn)移至C'生成最終的產(chǎn)物，其中C'-S'鍵的斷裂過程為催化反應(yīng)的決速步驟，對(duì)應(yīng)的能壘為17.4 kcal/mol。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步理解RlmN及其同源酶Cfr的催化反應(yīng)提供了理論依據(jù)。
　　(2)牙齦卟啉單胞菌酞酰精氨酸脫氨酶催化機(jī)理的理論研

5、究
　　牙齦卟啉單胞菌酞酰精氨酸脫氨酶催化多肽C-末端精氨酸的胍基化。精氨酸的胍基化反應(yīng)在生理活動(dòng)和病理過程中廣泛存在。研究牙齦卟啉單胞菌酞酰精氨酸脫氨酶的胍基化機(jī)理將為該酶在臨床上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。在研究酶的催化機(jī)理前，首先確定了活性中心兩個(gè)關(guān)鍵殘基C351和H236的質(zhì)子化狀態(tài)，然后對(duì)酶催化的胍基化反應(yīng)進(jìn)行了理論計(jì)算。結(jié)果表明，反應(yīng)經(jīng)過脫氨和水解兩個(gè)連續(xù)的過程，脫氨過程總能壘為20.17 kcal/mol;水解過程中，D23

6、8或H236殘基皆可作為堿活化水分子，并且對(duì)應(yīng)相似的能壘(～17 kcal/mol)。
　　(3)短芽胞桿菌中乙酰乳酸脫羧酶催化機(jī)理的理論研究
　　乙酰乳酸脫羧酶催化α-乙酰乳酸的對(duì)映異構(gòu)體生成單一的產(chǎn)物(R)-乙偶姻。其中(S)-α-乙酰乳酸為自然底物，催化反應(yīng)速度較快，(R)-α-乙酰乳酸為非自然底物反應(yīng)速度較慢。本論文應(yīng)用QM/MM方法研究了乙酰乳酸脫羧酶的催化機(jī)理。計(jì)算結(jié)果表明，乙酸乳酸脫羧酶對(duì)(S)-α-乙酰乳酸的

7、催化反應(yīng)包含兩步基元反應(yīng)，包括底物直接脫羧生成烯醇化物中間體以及烯醇中間體奪取E253殘基上的質(zhì)子生成最終的產(chǎn)物。研究結(jié)果還表明，非自然底物(R)-α-乙酰乳酸活性位點(diǎn)不能直接進(jìn)行脫羧反應(yīng)，需要先經(jīng)過羧基遷移重排為自然的底物(S)-α-乙酰乳酸，然后再按照(S)-α-乙酰乳酸的反應(yīng)機(jī)理完成催化反應(yīng)。
　　本論文的特色和創(chuàng)新之處:
　　(1)研究了SAM甲基轉(zhuǎn)移酶(RlmN)的催化反應(yīng)機(jī)理，確定了RlmN-tRNA復(fù)合體的分解

8、機(jī)制，給出了甲基化過程的決速步驟，在原子水平上總結(jié)了RNA甲基化過程中的自由基傳遞規(guī)律，為深入理解RlmN及其同源酶的催化過程提供了理論依據(jù)。
　　(2)研究了牙齦卟啉單胞菌酞酰精氨酸脫氨酶(PPAD)的胍基化反應(yīng)機(jī)理，確定了PPAD酶活性中心半胱氨酸和組氨酸的質(zhì)子化狀態(tài)以及PPAD酶催化反應(yīng)的脫氨和水解過程，解釋了C351-D238-H236催化三聯(lián)體在酶的催化過程中所起的重要作用。
　　(3)研究了短芽胞桿菌中乙酰乳酸脫