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1、一、編碼大鼠PRMT1基因shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定。 目的:為研究蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(PRMT1)基因表達(dá)的改變與血管內(nèi)皮功能及動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系,我們構(gòu)建了PRMT1短發(fā)夾RNA質(zhì)粒(pPRMT1-shRNA)。 方法:在GenBank中查到大鼠PRMT1基因mRNA序列并輸入siRNA網(wǎng)上設(shè)計(jì)軟件OptiRNA中,選取兩條靶序列,設(shè)計(jì)并合成編碼shRNA序列的DNA單鏈,經(jīng)退火連接后,與雙酶切線性化處理回收的
2、pGenesil-1質(zhì)粒載體連接,用含卡那霉素抗性的LB平板篩選陽性克隆,小提質(zhì)粒后行酶切鑒定并測(cè)序。 結(jié)果:構(gòu)建的大鼠pPRMT1-shRNA經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序與預(yù)期相符。 結(jié)論:本研究結(jié)果為進(jìn)一步進(jìn)行體外基因干擾PRMT1研究奠定了基礎(chǔ)。 二、PRMT1-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞條件的優(yōu)化目的:優(yōu)化pPRMT1-shRNA在聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染劑jetPEITM-RGD介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞
3、的轉(zhuǎn)染條件。 方法:貼塊法原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法(S-P法)鑒定,取3~4代細(xì)胞,按不同jetPEITM-RGD/pPRMT1-shRNA比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染,24小時(shí)后測(cè)定各組轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞存活率。 結(jié)果:6孔培養(yǎng)板每孔加入3.0μg的pPRA4T1-shRNA并以N/P=5加入jetPEITM-RGD轉(zhuǎn)染效率最高,為53.54%。 結(jié)論:本研究為高效地進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染及進(jìn)一步研究基因干擾PRMT1基
4、因?qū)ρ獫{同型半胱氨酸(Hcy)、非對(duì)稱性二甲基精氨酸(ADMA)水平和血管內(nèi)皮功能的影響奠定了基礎(chǔ)。 三、PRMT1-shRNA質(zhì)粒對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞PRMT1表達(dá)的影響。 目的:探討pPRMT1-shRNA在體外對(duì)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞PRMT1基因mRNA表達(dá)水平的影響。 方法:用pPRMT1-shRNA1、pPRMT1-shRNA2陽性質(zhì)粒、陰性對(duì)照pHK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染1
5、2、24小時(shí)后分別收集各組細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、2%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析系統(tǒng)分析各組PRMT1基因的mRNA表達(dá)情況。 結(jié)果:pPRMT1-shRNA1及pPRMT1-shRNA2轉(zhuǎn)染組12、24小時(shí)PRMT1基因mRNA表達(dá)較陰性對(duì)照pHK及空白對(duì)照組均明顯降低(P<0.01);pPRMT1-shRNA1及pPRMT1-shRNA2轉(zhuǎn)染組24小時(shí)PRMT1基因mRNA表達(dá)受抑較
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