小麥抗條銹病基因Yr41的精細定位和兩個條銹菌誘導表達基因的功能研究.pdf

1、小麥條銹病是由條銹菌(Puccinia striiformis West.f.sp.tritici)引起的葉部真菌病害，是世界性的小麥病害，在中國尤為嚴重，嚴重危害小麥產(chǎn)量與品質(zhì)。培育抗病小麥品種是防治條銹病的有效方法，但隨著條銹菌新生理小種的不斷出現(xiàn)，特別是V26新小種的出現(xiàn)，致使大部分抗病小麥品種喪失抗性。通過對抗病基因緊密連鎖的分子標記開發(fā)和精細定位，為抗病基因的克隆、分子標記輔助育種和多基因聚合的持久抗性品種培育奠定基礎，對小麥

2、抗條銹病遺傳育種研究具有理論和實踐價值。小麥抗病防御反應是多基因參與的調(diào)控過程，通過對抗條銹病調(diào)控基因的克隆與表達特性分析，探討這些基因在抗條銹病防御反應中的作用機理，為闡明寄主與條銹菌間互作的分子機理提供科學依據(jù)。
　　本研究以抗條銹病基因Yr41載帶的小麥抗病品種川農(nóng)19(CN19)為研究材料，通過構建的CN19/MY11遺傳連鎖作圖群體及其高代重組自交系，進行了條銹菌CRY32接種下的作圖群體單株抗病性鑒定和遺傳分析;采用比

3、較基因組分析和BSA-RNA-Seq測序方法，進行了EST-STS和SNP引物的開發(fā)和標記篩選，繪制Yr41基因的精細連鎖遺傳圖;利用實時熒光定量PCR(Q-RT-PCR)與病毒誘;基因沉默(VIGS)的技術，對已克隆的條銹菌誘導表達基因TaLHY和TaNIT，進行了基因表達特性與功能研究，主要研究結果如下:
　　1.配制了小麥品種CN19/MY11雜交F1、F2、F2∶3代研究群體，進行了抗條銹病遺傳分析，進一步明確了小麥品種C

4、N19中含有的Yr41基因是一個顯性的成株期抗條銹病基因;構建了含3212個單株的CN19/MY11雜交F2代遺傳作圖群體及其高代重組自交系，通過小麥2BS上公布的EST序列，設計了127個EST-STS分子標記引物，利用F2∶3分離群體分組法(BSA)對該EST-STS引物進行篩選，共獲得了8對與Yr41基因基因緊密連鎖的分子標記，通過Kosambi函數(shù)計算與目的基因的連鎖關系:BE444541-BE474133-BE604911-Y

5、r41-BE446068-BE444659-BF478477-BI479116-BE496167，分子標記間相對遺傳距離分別為0.83、0.19、0.06、0.19、0.06、0.44、0.19與0.32cM，使Yr41基因兩邊連鎖標記距離由8.9cM縮短至0.25cM，最小標記達到0.06cM，將Yr41基因進一步定位在小麥2BS3-0.84-1.00區(qū)段內(nèi)。
　　2.通過Blast本地化程序?qū)⒕o密連鎖的8條EST序列與小麥基因

6、組草圖以及短柄草、水稻和玉米基因組進行同源關系分析，根據(jù)同源基因位點，共設計201個分子標記，但篩選結果顯示這些分子標記與Yr41沒有連鎖關系。通過生物信息學方法對這8條EST序列對應的基因注釋結果顯示，近共分離的EST序列BE604911注釋信息為THO復合體，該蛋白在擬南芥中證實為植物抗病防御的關鍵蛋白，可作為Yr41的候選基因進一步研究。
　　3.通過對重組自交系(RIL)F6代中抗病和感病兩個表現(xiàn)型50(純抗)+50（純感

7、）樣本組進行BSA-RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組高通量測序，共得到57.14Gb Clean Data。利用生物信息方法對這些數(shù)據(jù)進行分析，共計注釋約1.5萬個小麥新基因，在抗病和感病兩個表現(xiàn)型樣本組中篩選到5919個差異表達基因。對BSA群體進行SNP位點的關聯(lián)定位分析，在2BS染色體上尋找到52個SNP位點，其中有38個SNP位點設計出四引物擴增受阻突變體系引物。通過對作圖群體單株DNA的PCR產(chǎn)物檢測，共計發(fā)現(xiàn)4個SNP位點與Yr41緊密

8、連鎖，他們與目的基因的連鎖關系為3523042/2963-3523042/3033-5186704/3797-Yr41-5245446/8902，其中3523042/2963、3523042/3033與5186704/3797分子標記與目的基因的遺傳距離為0.06 cM，5245446/8902分子標記的遺傳距離為0.25cM，增加了Yr41所在區(qū)段的密度。
　　4.對TaLHY基因的表達和功能研究結果初步證明了該基因調(diào)控和參與小

9、麥的穗生長與抗條銹病的防御反應過程;發(fā)現(xiàn)TaLHY是小麥晝夜節(jié)律基因，具有白天上調(diào)表達，夜晚下調(diào)表達量特性。利用實時熒光定量PCR的結果顯示，TaLHY基因主要在小麥葉、穗與莖組織中表達，根部表達較少;外源激素SA能極顯著的誘導該基因上調(diào)表達。在拔節(jié)期對抗病小麥CN19進行VIGS基因沉默，發(fā)現(xiàn)TaLHY沉默植株無法抽穗，對條銹菌生理小種條中32親和互作表現(xiàn)感病(IT=4)。
　　5.利用VIGS方法對克隆的TaNIT(晴水解酶)