朵麗蝶蘭成花相關基因DhEFL4基因和啟動子的分離與功能驗證.pdf

1、朵麗蝶蘭(Doritaenopsis)由蝴蝶蘭(Phalaenopsis)與朵麗蘭(Doritis)雜交而成屬于廣義上的蝴蝶蘭,由于其花色艷麗,花期持久,因而深受消費者歡迎,市場占有率高,具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟價值。
　　本研究通過在Hong-Hwa Chen建立的OrchidBase的cDNA文庫中的EST序列進行比對分析,篩選出兩個與玉米(Zea mays)中EFL4同源性很高的序列,以出瓶7個月左右的朵麗蝶蘭‘Tinny

2、Tender’(Doritaenopsis Happy smile×Happy valentine)克隆苗為試材,利用RACE技術分離基因的cDNA序列,并通過轉基因進行功能驗證。同時利用染色體步移技術獲得DhEFL4啟動子序列。取得的主要研究結果如下:
　　1、利用RACE的方法克隆到了朵麗蝶蘭中DhEFL4基因的cDNA序列,其中,獲得了DhEFL4基因的cDNA序列593bp bp,含有一個345 bp的ORF區(qū),編碼114

3、個氨基酸。
　　2、通過由處于光照進入黑暗時分朵麗蝶蘭的根、莖、葉、花梗、花蕾及花器官(花瓣、萼片、唇瓣和蕊柱)進行實時定量PCR,發(fā)現(xiàn)花蕾的表達量最高,說明DhEFL4和朵麗蝶蘭成花相關。同時分別采集短日照和長日照處理條件下朵麗蝶蘭的葉片(一晝夜中每隔兩小時采集一次),將長日照和短日照的葉片分別進行實時定量PCR,建立了DhEFL4基因的晝夜節(jié)律,結果顯示DhEFL4基因具備明顯又規(guī)律的晝夜節(jié)律性,而且長、短日照下的表達規(guī)律不同

4、,說明日照時間還是會影響到朵麗蝶蘭的成花,即使朵麗蝶蘭是光鈍感植物。
　　3、以pCAMBIA1301為植物表達載體,pMD20-T為中間載體,構建了PC1301-DhEFL4正義表達載體。
　　4、采用蘸花法侵染擬南芥,利用潮霉素篩選純合子并觀察其表型變化,結果表明,DhEFL4轉基因植株的開花時間有很明顯的延遲,并且抽葶數(shù)增加,在DNA和RNA水平上均能檢測到相應基因在轉基因植株體內(nèi)的表達,這一結果與擬南芥中的報道基本一