油菜BnMKK4基因的克隆、表達分析及其啟動子的分離和活性研究.pdf

1、植物生長發(fā)育過程中,常常受到外界環(huán)境脅迫的影響,而植物在長期的進化過程中形成了完整的防御機制用以抵御各種環(huán)境脅迫。植物體內(nèi)存在的促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)途徑在植物應(yīng)對生物和非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要作用。MAPK途徑存在于所有真核細胞中,其有三個組成成分:MAPK,MAPKK和MAPKKK,它們按照MAPKKK→MAPKK→MAPK的方式依次磷酸化把胞外刺激傳遞

2、至細胞內(nèi)。在MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,MAPKKs接受來自MAPKKKs的信號并對信息進行整合,之后將這些信號傳遞至下游的MAPKs。因此研究油菜中的MKKs有利于探究其抗逆信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。組成型啟動子在植物基因工程中廣泛應(yīng)用,但是組成型啟動子不能對目的基因的表達進行時間和空間上的有效調(diào)控。因此研究誘導(dǎo)型啟動子非常重要。近年來,從植物中分離得到大量的MAPKKs,但是關(guān)于油菜MAPKKs的研究相對較少。本研究從油菜中分離得到一個C類MAPK

3、K基因,命名為BnMKK4,對該基因及其啟動子做了初步研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴從油菜中分離得到一個新的MAPKK基因 BnMKK4(GenBank登錄號為JF268686)。序列分析顯示:該基因全長1317 bp,其開放閱讀框編碼330個氨基酸;預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量為36.5 kDa,等電點為9.01,并且為含有多個磷酸化位點的親水性蛋白;預(yù)測蛋白的高級結(jié)構(gòu)富含α-螺旋和不規(guī)則卷曲。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示其為C類MAPKK

4、。⑵實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:BnMKK4基因在兩種油菜的莖、葉、下胚軸中均有表達,并且在葉中的表達量最高,低溫處理下,隴油6號油菜莖、葉、下胚軸中的BnMKK4基因的表達量均升高,而天油2號油菜僅葉片中該基因的表達量增加;在低溫處理下,隴油6號油菜葉片中BnMKK4基因的表達量持續(xù)上升,而天油2號油菜葉片中該基因的表達量先上升后下降;高鹽脅迫下,兩種油菜葉片中BnMKK4基因的表達量均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,但與天油2號相比,隴油

5、6號下降緩慢。結(jié)果表明BnMKK4可能參與調(diào)控油菜低溫和高鹽脅迫,并且隴油6號油菜的抗逆性可能更強。⑶構(gòu)建pBI121-BnMKK4-GFP表達載體,在洋蔥表皮細胞中進行瞬時表達,激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察綠色熒光位于細胞核,說明BnMKK4定位于細胞核。⑷從隴油6號油菜中克隆得到BnMKK4基因ATG上游的999bp序列,分析發(fā)現(xiàn)該序列含有與低溫、干旱、ABA脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的順勢作用元件,說明該啟動子可能受低溫、干旱和ABA脅迫的誘導(dǎo)。

6、⑸將5’端缺失啟動子片段構(gòu)建到pCAMBIA1302載體,與報告基因GFP融合,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞,激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的強度,結(jié)果表明BnMKK4啟動子活性的核心結(jié)構(gòu)位于ATG上游-416~-271bp之間。⑹將BnMKK4啟動子與GFP融合,利用洋蔥瞬時表達系統(tǒng)研究溫度和鹽脅迫下該啟動子的活性,結(jié)果表明該啟動子可能是低溫和高鹽誘導(dǎo)的啟動子。⑺UV-B脅迫下,在一定的脅迫時間內(nèi)兩種油菜抗氧化酶系統(tǒng)中