豬印記基因MAGEL2組織表達分析和啟動子的克隆與活性分析.pdf

1、MAGEL2基因在人、鼠和豬中都是父源表達，為母系印記基因，在下丘腦發(fā)揮重要的調(diào)控功能。鼠中該基因異常表達，不僅出現(xiàn)母鼠的后代照看、生物鐘調(diào)節(jié)和繁殖能力下降，而且公鼠的性行為出現(xiàn)嗅覺功能障礙，幼崽斷奶前死亡率上升。這些研究表明MAGLE2基因和哺乳動物的繁殖性狀有著重要的關系。本研究為了研究MAGEL2基因在豬中的表達與豬的母性行為的相關性，以母性差異極大的梅山豬與杜洛克豬作為研究對象，通過實時熒光定量PCR方法對下丘腦等13個組織的表

2、達情況做了分析，并對不同時期的胎盤表達做了分析;為進一步研究MAGEL2基因表達的分子機制，本研究克隆了MAGEL2基因的啟動子，對其進行了信息學分析，并構(gòu)建了啟動子缺失片段熒光素酶報告基因表達載體，利用細胞瞬時轉(zhuǎn)染技術對該基因進行了啟動子活性分析。
　　 本研究主要取得了如下結(jié)果和結(jié)論:
　　 1.本研究為分析MAGEL2基因在不同豬種以及不同組織間的表達差異，從而探討MAGEL2基因和豬繁殖性狀之間的關系，采用熒光定

3、量PCR技術檢測MAGEL2基因組織表達水平。MAGEL2基因在所有被檢測初生豬組織中都有表達，在下丘腦中的表達量最高(P＜0.01)，而且梅山豬下丘腦中的表達量極顯著高于杜洛克豬(P＜0.01)。雖然MAGEL2基因在梅山豬懷孕不同時期胎盤表達量沒有顯著性差異(P＞0.05)，但是梅山豬懷孕30天胎盤中表達量極顯著高于杜洛克豬(P＜0.01)，而且在分娩后脫落的胎盤中不表達。所以MAGEL2基因與豬母性行為和胎盤功能可能密切相關，是與

4、豬繁殖性狀相關的候選基因。
　　 2.通過5'RACE技術，克隆得到了MAGEL2基因110bp的5'UTR序列，確定了該基因的轉(zhuǎn)錄起始位點。根據(jù)豬基因組序列，克隆了梅山豬和杜洛克豬起始密碼子前約2kb的序列，對梅山豬啟動子1883bp和杜洛克豬啟動子1885bp，包含110bp的5'UTR序列，進行了信息學分析。結(jié)果顯示，兩種豬的序列存在9處堿基差異，其中梅山豬缺失了2個堿基，這些堿基的差異可能是造成該基因在不同豬種間差異表達

5、的原因之一。在這近2kb的范圍內(nèi)并不存在CpG島，但預測得到兩個得分較高的核心啟動子序列，為別為TTTTCCCCCTATATATTAACCTTGGATCTATTCATTCCTCATTTTATTAT(Atart:-1164,End:-1115,Score:0.87)和ATACCCCATTCTAAAAATGTTGCCACTTGTGGGTGTCTGGAACATCTCAA(Atart:-1002，End:-953，Score:0.97)，在18

6、85啟動子序列中TATA盒共有18個，而具有典型TATA盒序列特征的共有7個，位于轉(zhuǎn)錄起始位點前1000bp以內(nèi)，而且靠近轉(zhuǎn)錄起始位點100bp范圍內(nèi)有兩個GC盒(GGGCGG)，通過TESS網(wǎng)站預測，發(fā)現(xiàn)大量轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，包括很多常見的轉(zhuǎn)錄因子如Sp1、GR、YY1、C/EBPβ、TFIID的結(jié)合位點。這些特點預示著MAGEL2基因啟動子可能是個強啟動子，所以我們對其啟動子活性進行了試驗研究。
　　 3.通過亞克隆，載體構(gòu)

7、建等技術成功構(gòu)建了MAGEL2基因啟動子缺失片段熒光素酶報告基因表達載體pGL3-110、pGL3-261、pGL3-466和pGL3-1281。并利用細胞培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染技術，將上述載體轉(zhuǎn)入HEK293細胞，通過熒光素酶活性檢測分析了各啟動子缺失片段的活性，結(jié)果表明，pGL3-110載體熒光素酶活性較低，和陰性對照沒有顯著性差異(P＞0.05);pGL3-261載體相對熒光素酶活性最高，pGL3-466和pGL3-1281載體的相對活性