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文檔簡介
1、宮內(nèi)發(fā)育遲緩和先兆子癇致病因素多樣,病情表現(xiàn)各異,目前關(guān)于它們的具體病理原因還不確定,但溯其根源,這兩種妊娠異常疾病都是由于胎盤機能不全造成的。目前已有一些報道的胎盤特異性生物化學(xué)標(biāo)記可用于鑒定先兆子癇,但這方面的信息還不全面,可用于臨床的生物標(biāo)記很少;而對于宮內(nèi)發(fā)育遲緩,由于該疾病病理的高異質(zhì)性、多樣性,以及與其他疾病同時發(fā)生等原因,傳統(tǒng)的臨床分類很難體現(xiàn)真實的病理分類信息,從而導(dǎo)致從基因組水平研究該疾病的分子機理存在一定困難。另一方
2、面,microRNA作為重要的基因表達調(diào)控元件,廣泛參與到很多胎盤發(fā)育相關(guān)的生物過程中(如細胞分化、增殖、凋亡、侵入及血管生成等),同時也可作為循環(huán)系統(tǒng)中穩(wěn)定的生物標(biāo)記。因此,本研究的目的是揭示人類胎盤的轉(zhuǎn)錄組,分析先兆子癇和宮內(nèi)發(fā)育遲緩中特異性的差異表達基因,根據(jù)差異表達基因篩選差異表達的microRNAs,作為預(yù)測先兆子癇和宮內(nèi)發(fā)育遲緩的分子標(biāo)記。為了實現(xiàn)此目的,本研究采用IlluminaHuman6.0BeadArray對86個人
3、類胎盤樣品的轉(zhuǎn)錄組展開研究,并綜合運用可調(diào)模塊性聚類分析(ModulatedModularityClustering,MMC)和基因集合富集分析(GeneSetsEnrichmentAnalysis,GSEA)預(yù)測差異表達microRNAs,然后利用實時定量PCR驗證候選microRNAs在胎盤中的差異表達并構(gòu)建預(yù)測異常妊娠的決定樹,最后研究了microRNA作為分子標(biāo)記在母體血漿中的穩(wěn)定性。主要結(jié)果如下:
(1)根據(jù)原始
4、臨床分類信息,從先兆子癇中鑒定到128個基因在保守的Bonferronip<0.05水平上表達差異顯著,2109個基因在FDR<0.05水平上表達差異顯著;而在宮內(nèi)發(fā)育遲緩胎盤中,僅能鑒定到1個基因在保守的Bonferronip<0.05水平上差異顯著,26個基因在FDR<0.05水平上差異顯著,說明宮內(nèi)發(fā)育遲緩樣品存在高異質(zhì)性。
(2)通過可調(diào)模塊性聚類分析(MMC),鑒定到兩個分別代表宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)和先兆子癇
5、(PE)的模塊,它們分別是模塊3和模塊5。其中模塊3僅由IUGR胎盤組成,模塊5由11個PE和7個IUGR胎盤共同組成,且其中7個IUGR胎盤中有4個同時被診斷為PE,由此可以看出,模塊3代表IUGR,而模塊5代表PE。
(3)根據(jù)由MMC獲得的新分組信息進行差異表達基因分析,從代表先兆子癇的模塊5中鑒定到889個基因在保守的Bonferronip<0.05水平上表達差異顯著,5184個基因在FDR<0.05水平上表達差異
6、顯著;而從代表宮內(nèi)發(fā)育遲緩的模塊3中鑒定到326個基因在保守的Bonferronip<0.05水平上表達差異顯著,2100個基因在FDR<0.05水平上表達差異顯著。
(4)將異常胎盤內(nèi)差異表達基因進行通路分析,獲得的通路主要與細胞生長、分化及發(fā)育相關(guān)。由模塊3中差異表達基因富集到的通路主要包括P13K、AKT、mTOR、eIF4、p70S6K信號通路,細胞凋亡信號通路,和IGF-1信號通路;由模塊5中差異表達基因富集到的
7、通路包括EIF2信號通路、RhoGDI信號通路,mTOR信號通路,以及與免疫反應(yīng)相關(guān)的通路,如白細胞外滲信號通路、Fcg受體介導(dǎo)的巨噬細胞和單核細胞吞噬通路,以及CXCR4信號通路。
(5)根據(jù)異常胎盤內(nèi)差異表達的分子標(biāo)簽,基因集合富集分析(GSEA)預(yù)測了差異表達的候選microRNA,選擇其中六個最顯著的microRNA(miR-520A-5p,miR-194,miR-412,miR-149,miR-483,miR-5
8、03)作為候選分子標(biāo)記。實時定量PCR結(jié)果顯示,miR-194在先兆子癇(p=0.0001)和宮內(nèi)發(fā)育遲緩(p=0.0304)胎盤中的表達水平都顯著下降,miR-149在先兆子癇(p=0.0168)中表達水平顯著下降。
(6)根據(jù)6個候選microRNA在71個胎盤中的表達水平,分別構(gòu)建了預(yù)測先兆子癇和宮內(nèi)發(fā)育遲緩的決定樹。根據(jù)排列置換檢測,所得決定樹均在統(tǒng)計學(xué)上意義顯著(p<0.05)。
(7)三個廣泛表達
9、的miRNAs(miR-16,miR-15,miR-24)在血漿中的水平保持恒定,不受室溫及反復(fù)凍融次數(shù)的影響;本研究中的差異表達miRNAs(miR-149,miR-194)在母本血漿中同樣非常穩(wěn)定,不受室溫及反復(fù)凍融次數(shù)的影響。說明組織釋放的microRNA穩(wěn)定地存在于外周循環(huán)血液中。
另一方面,由于印記基因?qū)Σ溉閯游锱咛グl(fā)育和出生后的生長發(fā)育都有重要作用,在人異常胎盤的轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)很多印記基因的表達受到影響,而且影響
10、家畜數(shù)量性狀的一些基因同時存在印記現(xiàn)象,因此本研究另一目的是以豬為模式動物,研究候選印記基因MAGEL2在兩個胚胎時期中的印記狀態(tài)以及該基因多態(tài)位點與豬胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析。主要結(jié)果如下:
(1)豬MAGEL2基因與其人和小鼠中的同源基因一樣,為無內(nèi)含子基因。該基因主要在65日齡胚胎的腦、胎盤中高表達,其次是心臟,而在脾、肺、腎、胃、小腸和肌肉中的表達水平偏低,在肝中的表達水平最微弱。
(2)豬MAGEL2基因
11、在65日齡胚胎所有被檢測組織(心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉、腦、胎盤)中均母本印記、父本表達,而在30日齡胚胎中存在印記多態(tài)性,即16個雜合子胚胎中有2個胚胎逃脫印記,說明在胚胎早期發(fā)育階段穩(wěn)定的印記還未建立完善。
(3)大白×梅山F2代資源家系中的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,豬MAGEL2基因的多態(tài)位點g.2592A>C與屠宰率和臀部背膘厚顯著相關(guān)(p<0.05),g.3277T>C與骨率顯著相關(guān)(p<0.05),他們可能成為
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