豬PNAS-4基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄特征分析.pdf

1、豬PNAS-4基因是通過cDNA宏陣列(Macroarray)技術(shù)從大白母豬妊娠55天的胎兒背最長(zhǎng)肌和股二頭肌建立的cDNA文庫(kù)中篩選出來的，研究人員在前期研究中發(fā)現(xiàn)，該基因在胚胎期呈下調(diào)表達(dá)模式，而在出生后呈上調(diào)表達(dá)，同時(shí)該基因在各組織中存在表達(dá)量的差異，其中，骨骼肌和淋巴組織中表達(dá)量最高，在背膘中也有較高的表達(dá)，腎和大腦中表達(dá)量最低，推測(cè)該基因與豬的肌肉發(fā)育以及脂肪沉積性能有一定的關(guān)系。檢索相關(guān)文獻(xiàn)，在人和鼠中該基因的研究主要集中在

2、腫瘤細(xì)胞凋亡與胚胎分化發(fā)育過程中的作用，至于該基因自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征卻并沒有涉及，這成為進(jìn)一步揭示其功能和利用其進(jìn)行相關(guān)方面的應(yīng)用的制約因素。有鑒于此，我們希望通過本研究，推進(jìn)豬PNAS-4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究，以期促進(jìn)該基因的功能研究和利用。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)利用Real-Time PCR檢測(cè)了小鼠PNAS-4基因在小鼠成肌細(xì)胞C2C12以及小鼠前體脂肪細(xì)胞3T3-L1分化過程中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PNAS-4基因

3、在C2C12細(xì)胞分化過程中的表達(dá)規(guī)律類似該基因在肌肉發(fā)育中的表達(dá)規(guī)律，即是分化前期表達(dá)量相對(duì)維持一個(gè)較高水平，在后期表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，和C2C12細(xì)胞分化的標(biāo)志基因MYOD、MYOG的表達(dá)趨勢(shì)相反。在3T3-L1細(xì)胞中未分化時(shí)的表達(dá)明顯高于分化后，和3T3-L1細(xì)胞分化的標(biāo)志基因C/EBPa、Pparg的表達(dá)趨勢(shì)相反。
　　 (2)通過長(zhǎng)片段PCR技術(shù)獲得含有豬PNAS-4基因5'側(cè)翼序列的片段信息，然后克隆、測(cè)序得到豬PNAS

4、-4基因的啟動(dòng)子。構(gòu)建各種缺失片段雙熒光報(bào)告基因質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，找到了該基因的核心啟動(dòng)子區(qū)-346～-254(翻譯起始密碼子的A設(shè)為+1)。利用啟動(dòng)子分析軟件TESS對(duì)豬的PNAS-4基因核心啟動(dòng)子中的可能的順式作用元件進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并構(gòu)建這些順式作用元件結(jié)合位點(diǎn)突變的報(bào)告基因質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染然后，發(fā)現(xiàn)該核心區(qū)域內(nèi)的-307～-298 l0bp預(yù)測(cè)Spl結(jié)合位點(diǎn)(命名為Spl.3)對(duì)該啟動(dòng)子活性影響很大。最后通過凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)(EMSA)證實(shí)

5、了PNAS-4基因啟動(dòng)子中的Spl.3結(jié)合位點(diǎn)的真實(shí)性，由此推斷轉(zhuǎn)錄因子Spl可以通過結(jié)合在Spl.3位點(diǎn)增高PNAS-4基因啟動(dòng)子活性。
　　 本論文通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了PNAS-4基因在小鼠成肌細(xì)胞C2C12以及小鼠前體脂肪細(xì)胞3T3-L1中的表達(dá)情況，以驗(yàn)證其與肌肉發(fā)育脂肪沉積可能的關(guān)系，在此基礎(chǔ)上對(duì)豬PNAS-4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征進(jìn)行分析。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)結(jié)合啟動(dòng)子研究經(jīng)典途徑找到了調(diào)控PNAS-4基因基礎(chǔ)表達(dá)